Bij het bestuderen van stoffen in de organische chemie worden meer dan een dozijn verschillende kwalitatieve reacties gebruikt om het geh alte van bepaalde verbindingen te bepalen. Met zo'n visuele analyse kun je meteen begrijpen of de benodigde stoffen aanwezig zijn, en als ze niet aanwezig zijn, kun je verdere experimenten om ze te identificeren aanzienlijk verminderen. Deze reacties omvatten ninhydrine, dat de belangrijkste is bij de visuele bepaling van aminoverbindingen.
Wat is dit?
Ninhydrine is een dicarbonylverbinding die één aromatische ring bevat met daaraan een heteroring, waarvan het tweede atoom 2 hydroxylgroepen heeft (OH-). Deze stof wordt verkregen door directe oxidatie van inandion - 1, 3, en daarom heeft het volgens de internationale nomenclatuur de volgende naam: 2, 2 - dihydroxyinandion -1, 3 (Fig. 1).
Pure ninhydrine is een geel of wit kristalkleuren die bij verhitting goed oplossen in water en andere polaire organische oplosmiddelen, zoals aceton. Dit is een nogal schadelijke stof, als het in grote hoeveelheden in contact komt met de huid of slijmvliezen, veroorzaakt het irritatie, ook bij inademing. Werk met deze verbinding moet voorzichtig zijn en alleen met handschoenen, want wanneer het in contact komt met de huid, reageert het met huidceleiwitten en kleurt het paars.
Reactieve stoffen
Zoals hierboven vermeld, wordt de ninhydrinereactie voornamelijk gebruikt voor de visuele bepaling van het geh alte aan aminoverbindingen:
- α-aminozuren (ook in eiwitten);
- aminosuikers;
- alkaloïden die –NH2 en -NH groepen bevatten;
- verschillende amines.
Opgemerkt moet worden dat secundaire en tertiaire amines soms zeer zwak reageren, dus er is meer onderzoek nodig om hun aanwezigheid te bevestigen.
Er worden verschillende methoden van chromatografie gebruikt voor kwantitatieve bepaling, bijvoorbeeld papierchromatografie (BC), dunnelaagchromatografie (TLC) of het wassen van vaste dragers met een oplossing van ninhydrine in verschillende media.
Deze reactie is niet specifiek voor aminoverbindingen, omdat het reagens er allemaal tegelijk in kan komen. Aan de kant van de reactieproducten heeft het echter een eigenaardigheid in de vorm van het vrijkomen van kooldioxidebellen (CO2), en dit is alleen typisch bij interactie met α-amino zuren.
Mechanismekenmerken
BEr zijn verschillende interpretaties van de ninhydrinereactievergelijking in de literatuur. Sommige onderzoekers laten de vorming van hydrindanthine uit 2-aminoinandione weg, dat, met de deelname van ammoniak en ninhydrine, ook een kleurstof vormt die "Rueman's purple" (of "Rueman's blue") wordt genoemd, terwijl anderen daarentegen alleen zijn deelname zonder de aanwezigheid van intermediaire aminoproducten. Er zijn ook enkele interessante punten in het verslag van de reactie zelf, met name de methoden om het aminoderivaat van ninhydrine aan zijn hoofdmolecuul te hechten om een kleurstof te vormen. De aanduiding van de plaats van de "lopende waterstof" die wordt verkregen door het intermediaire amine uit het waterige medium blijft ook twijfelachtig: het kan ofwel in de ketongroep zijn of naast –NH2.
In werkelijkheid is de nuance met het H-atoom onbeduidend, omdat zijn positie in de verbinding geen speciale rol speelt in het verloop van de reactie, dus er moet geen aandacht aan worden besteed. Wat betreft het weglaten van een van de mogelijke fasen, ligt de reden hier in het theoretische aspect: tot nu toe is het exacte mechanisme voor de vorming van Rueman's paars niet precies bepaald, dus er kunnen heel verschillende schema's van de ninhydrinereactie worden gevonden.
Het meest volledig mogelijke verloop van de interactie van het reagens met aminoverbindingen zal hieronder worden voorgesteld.
Reactiemechanisme
Ten eerste interageert ninhydrine met α-aminozuur, hecht het aan de plaats van splitsing van hydroxygroepen en vormt een condensatieproduct (Fig. 2a). Vervolgens wordt de laatste vernietigd, waarbij het tussenproduct amine, aldehyde en koolstofdioxide vrijkomt (figuur 2b). Van het eindproduct bij deelnameninhydrine, de Rueman paarse structuur (diketonhydrindenketohydrinamine, Fig. 2c) wordt gesynthetiseerd. Ook aangegeven is de mogelijke vorming van hydrindanthine (gereduceerd ninhydrine) uit het tussenproduct amine, dat ook verandert in een kleurstof in aanwezigheid van ammoniak (meer precies, ammoniumhydroxide) met een overmaat van het reagens zelf (Fig. 2d).
De vorming van hydrindantine werd door Rueman zelf bewezen wanneer waterstofsulfide inwerkt op het ninhydrinemolecuul. Deze verbinding kan oplossen in natriumcarbonaat Na2CO3, waardoor de oplossing donkerrood wordt. En wanneer verdund zoutzuur wordt toegevoegd, slaat hydrindanthine neer.
Hoogstwaarschijnlijk zijn het tussenproduct amine, hydridanthine, ninhydrine en de structuur van de kleurstof, vanwege hun instabiliteit bij verhitting, in enig evenwicht, wat de aanwezigheid van verschillende extra stadia mogelijk maakt.
Dit mechanisme is geschikt om de ninhydrinereactie met andere aminoverbindingen te verklaren, met uitzondering van bijproducten die het gevolg zijn van de eliminatie van de rest van de structuur uit –NH2, -NH of -N.
Biureet-test en andere reacties op eiwitten
Kwalitatieve analyse van peptidebindingen, zelfs van niet-eiwitstructuren, kan niet alleen plaatsvinden met de deelname van het bovenstaande reagens. Bij een ninhydrinereactie op eiwitten vindt de interactie echter niet plaats langs –CO-NH‒-groepen, maar langs aminegroepen. Er is een zogenaamde "biureetreactie", die wordt gekenmerkt door de toevoeging van ionen aan de oplossing met aminoverbindingentweewaardig koper uit CuSO4 of Cu(OH)2 in een alkalisch medium (Fig. 3).
Tijdens de analyse, in aanwezigheid van de nodige structuren, wordt de oplossing donkerblauw door de binding van peptidebindingen tot een kleurencomplex, dat het ene reagens van het andere onderscheidt. Daarom zijn de biureet- en ninhydrinereacties universeel in relatie tot eiwit- en niet-eiwitstructuren met de –CO-NH‒-groep.
Bij het bepalen van cyclische aminozuren wordt een xantoproteïne-reactie met een geconcentreerde oplossing van salpeterzuur HNO3 gebruikt, die bij nitrering een gele kleur geeft. Een druppel reagens op de huid vertoont ook een gele kleur door te reageren met de aminozuren in de huidcellen. Salpeterzuur kan brandwonden veroorzaken en moet ook met handschoenen worden gehanteerd.
Voorbeelden van interactie met aminoverbindingen
Ninhydrinereactie voor α-aminozuren geeft een goed visueel resultaat, behalve de kleurstructuren proline en hydroxyproline, die reageren met de vorming van een gele kleur. Een mogelijke verklaring voor dit effect werd gevonden in andere omgevingscondities van de interactie van ninhydrine met deze structuren.
Reactie met aminogroep
Omdat de test niet specifiek is, is visuele detectie van alanine met behulp van de ninhydrinereactie in het mengsel niet mogelijk. Door middel van papierchromatografie kan men echter bij het aanbrengen van monsters van verschillende α-aminozuren, deze besproeien met een waterige oplossing van ninhydrine en ontwikkelen in een speciaal medium,bereken de kwantitatieve samenstelling van niet alleen de geclaimde verbinding, maar ook van vele andere.
Schematisch volgt de interactie van alanine met ninhydrine hetzelfde principe. Het hecht zich aan het reagens bij de aminegroep en wordt onder de werking van actieve hydroniumionen (H3O+) afgesplitst bij de koolstof -stikstofbinding, ontbindend in aceetaldehyde (CH3COH) en koolstofdioxide (CO2). Een ander ninhydrinemolecuul hecht zich aan stikstof, verdringt watermoleculen, en er wordt een kleurende structuur gevormd (Fig. 4).
Reactie met een heterocyclische aminoverbinding
De ninhydrinereactie met proline is specifiek, vooral bij chromatografische analyses, omdat dergelijke structuren in een zuur medium eerst geel worden en vervolgens paars in een neutraal medium. De onderzoekers verklaren dit door een kenmerk van de cyclusomlegging in de intermediaire verbinding, die juist wordt beïnvloed door de aanwezigheid van een groot aantal waterstofprotonen die het externe energieniveau van stikstof aanvullen.
De vernietiging van de heterocyclus vindt niet plaats, en een ander ninhydrinemolecuul is eraan gehecht bij het 4e koolstofatoom. Bij verdere verwarming verandert de resulterende structuur in een neutraal medium in Rueman-paars (Fig. 5).
Bereiding van het hoofdreagens
Ninhydrine-test wordt uitgevoerd met verschillende oplossingen, afhankelijk van het oplossen van aminostructuren in bepaalde organische enanorganische verbindingen.
Het belangrijkste reagens is de bereiding van een 0,2% oplossing in water. Dit is een veelzijdig mengsel, aangezien de meeste verbindingen goed oplossen in H2O. Om een vers bereid reagens te verkrijgen, wordt een monster van 0,2 g chemisch zuivere ninhydrine verdund in 100 ml water.
Het is vermeldenswaard dat voor sommige geanalyseerde oplossingen deze concentratie onvoldoende is, zodat oplossingen van 1% of 2% kunnen worden bereid. Dit is typisch voor extracten van medicinale grondstoffen, omdat ze verschillende klassen aminoverbindingen bevatten.
Bij het uitvoeren van chromatografische onderzoeken kunnen oplossingen, bijvoorbeeld bij het wassen van een mengsel op een vaste drager door een kolom, worden bereid in alcohol, dimethylsulfoxide, aceton en andere polaire oplosmiddelen - alles hangt af van het oplosmiddel van bepaalde aminostructuren.
Toepassing
De ninhydrinereactie maakt het mogelijk om veel aminoverbindingen in oplossing te detecteren, waardoor het een van de eerste was die werd gebruikt bij de kwalitatieve analyse van organische stoffen. Visuele bepaling vermindert het aantal experimenten aanzienlijk, vooral bij het analyseren van slecht bestudeerde planten, medicijnen en doseringsvormen, evenals onbekende oplossingen en mengsels.
In de forensische wetenschap wordt deze methode veel gebruikt om de aanwezigheid van zweetvlekken op elk oppervlak te bepalen.
Zelfs ondanks de niet-specificiteit van de reactie, is het onmogelijk om de ninhydrinereactie uit de chemische praktijk te halen, aangezienhet vervangen van deze stof door minder giftige analogen (bijvoorbeeld oxoline) bewees dat ze minder gevoelig zijn voor aminogroepen en geen goede resultaten geven in fotometrische analyses.
