Het concept van geïmmobiliseerde enzymen verscheen voor het eerst in de tweede helft van de 20e eeuw. Ondertussen, in 1916, werd ontdekt dat sucrose gesorbeerd op koolstof zijn katalytische activiteit behield. In 1953 voerden D. Schleit en N. Grubhofer de eerste binding uit van pepsine, amylase, carboxypeptidase en RNase met een onoplosbare drager. Het concept van geïmmobiliseerde enzymen werd in 1971 gelegaliseerd. Dit gebeurde op de eerste conferentie over technische enzymologie. Momenteel wordt het begrip geïmmobiliseerde enzymen in bredere zin beschouwd dan aan het einde van de 20e eeuw. Laten we deze categorie eens nader bekijken.
Algemene informatie
Geïmmobiliseerde enzymen zijn verbindingen die kunstmatig zijn gebonden aan een onoplosbare drager. Ze behouden echter hun katalytische eigenschappen. Momenteel wordt dit proces in twee aspecten beschouwd - in het kader van gedeeltelijke en volledige beperking van de bewegingsvrijheid van eiwitmoleculen.
Waardigheid
Wetenschappers hebben bepaalde voordelen van geïmmobiliseerde enzymen vastgesteld. Ze werken als heterogene katalysatoren en kunnen gemakkelijk van het reactiemedium worden gescheiden. Als onderdeel van het onderzoek werd gevonden dat het gebruik van geïmmobiliseerde enzymen kan worden herhaald. Tijdens het bindingsproces veranderen verbindingen van eigenschappen. Ze verwerven substraatspecificiteit en stabiliteit. Tegelijkertijd begint hun activiteit af te hangen van de omgevingsomstandigheden. Geïmmobiliseerde enzymen zijn duurzaam en hebben een hoge mate van stabiliteit. Het is duizenden, tienduizenden keren groter dan bijvoorbeeld die van vrije enzymen. Dit alles zorgt voor een hoge efficiëntie, concurrentievermogen en economie van technologieën waarin geïmmobiliseerde enzymen aanwezig zijn.
Media
J. Poratu identificeerde de belangrijkste eigenschappen van ideale materialen voor gebruik bij immobilisatie. Dragers moeten hebben:
- Onoplosbaarheid.
- Hoge biologische en chemische resistentie.
- De mogelijkheid om snel te activeren. De dragers zouden gemakkelijk reactief moeten worden.
- Aanzienlijke hydrofiliciteit.
- Noodzakelijke doorlaatbaarheid. De indicator moet even acceptabel zijn voor zowel enzymen als co-enzymen, reactieproducten en substraten.
Momenteel is er geen materiaal dat volledig aan deze eisen voldoet. Toch worden in de praktijk dragers gebruikt die geschikt zijn voor immobilisatie.bepaalde categorie enzymen onder specifieke omstandigheden.
Classificatie
Afhankelijk van hun aard worden de materialen, waarmee verbindingen worden omgezet in geïmmobiliseerde enzymen, onderverdeeld in anorganisch en organisch. De binding van veel verbindingen wordt uitgevoerd met polymere dragers. Deze organische materialen zijn onderverdeeld in 2 klassen: synthetisch en natuurlijk. In elk van hen worden op hun beurt groepen onderscheiden, afhankelijk van de structuur. Anorganische dragers worden voornamelijk vertegenwoordigd door materialen van glas, keramiek, klei, silicagel en grafietzwart. Bij het werken met materialen zijn droge-chemische methoden populair. Geïmmobiliseerde enzymen worden verkregen door dragers te coaten met een film van titanium, aluminium, zirkonium, hafniumoxiden of door verwerking met organische polymeren. Een belangrijk voordeel van materialen is het gemak van regeneratie.
Eiwitdragers
De meest populaire zijn lipide-, polysacharide- en eiwitmaterialen. Onder de laatste is het de moeite waard om structurele polymeren te benadrukken. Deze omvatten voornamelijk collageen, fibrine, keratine en gelatine. Dergelijke eiwitten zijn wijd verspreid in de natuurlijke omgeving. Ze zijn betaalbaar en zuinig. Bovendien hebben ze een groot aantal functionele groepen voor binding. Eiwitten zijn biologisch afbreekbaar. Hierdoor kan het gebruik van geïmmobiliseerde enzymen in de geneeskunde worden uitgebreid. Ondertussen hebben eiwitten ook negatieve eigenschappen. De nadelen van het gebruik van geïmmobiliseerde enzymen op eiwitdragers zijn de hoge immunogeniciteit van de laatste, evenals:de mogelijkheid om alleen bepaalde groepen ervan in reacties te introduceren.
Polysachariden, aminosachariden
Van deze materialen worden chitine, dextran, cellulose, agarose en hun derivaten het vaakst gebruikt. Om polysachariden beter bestand te maken tegen reacties, zijn hun lineaire ketens verknoopt met epichloorhydrine. Verschillende ionogene groepen worden vrijelijk in de netwerkstructuren geïntroduceerd. Chitine hoopt zich in grote hoeveelheden op als afvalstof bij de industriële verwerking van garnalen en krabben. Deze stof is bestand tegen chemicaliën en heeft een goed gedefinieerde poreuze structuur.
Synthetische polymeren
Deze groep materialen is zeer divers en toegankelijk. Het omvat polymeren op basis van acrylzuur, styreen, polyvinylalcohol, polyurethaan en polyamidepolymeren. De meeste zijn mechanisch sterk. Tijdens het transformatieproces bieden ze de mogelijkheid om de poriegrootte binnen een vrij breed bereik te variëren, waardoor verschillende functionele groepen worden geïntroduceerd.
Binding Methoden
Momenteel zijn er twee fundamenteel verschillende opties voor immobilisatie. De eerste is het verkrijgen van verbindingen zonder covalente bindingen met de drager. Deze methode is fysiek. Een andere optie is het ontstaan van een covalente binding met het materiaal. Dit is een chemische methode.
Adsorptie
Met behulp hiervan worden geïmmobiliseerde enzymen verkregen door het medicijn op het oppervlak van de drager te houden vanwegedispersie, hydrofobe, elektrostatische interacties en waterstofbruggen. Adsorptie was de eerste manier om de mobiliteit van elementen te beperken. Maar zelfs nu heeft deze optie zijn relevantie niet verloren. Bovendien wordt adsorptie beschouwd als de meest gebruikelijke immobilisatiemethode in de industrie.
Kenmerken van de methode
Wetenschappelijke publicaties beschrijven meer dan 70 enzymen verkregen door de adsorptiemethode. De dragers waren voornamelijk poreus glas, verschillende kleisoorten, polysachariden, aluminiumoxiden, synthetische polymeren, titanium en andere metalen. Deze laatste worden het meest gebruikt. De effectiviteit van adsorptie van het geneesmiddel op de drager wordt bepaald door de porositeit van het materiaal en het specifieke oppervlak.
Werkingsmechanisme
Enzymadsorptie op onoplosbare materialen is eenvoudig. Het wordt bereikt door contact van een waterige oplossing van het geneesmiddel met de drager. Het kan op een statische of dynamische manier passeren. De enzymoplossing wordt gemengd met vers sediment, bijvoorbeeld titaniumhydroxide. De verbinding wordt vervolgens onder milde omstandigheden gedroogd. Enzymactiviteit tijdens een dergelijke immobilisatie wordt met bijna 100% behouden. Tegelijkertijd bereikt de specifieke concentratie 64 mg per gram drager.
Negatieve momenten
De nadelen van adsorptie zijn onder meer een lage sterkte bij het binden van het enzym en de drager. Tijdens het veranderen van de reactieomstandigheden kunnen verlies van elementen, verontreiniging van producten en eiwitdesorptie worden opgemerkt. Om kracht te verbeterenbindende dragers zijn vooraf gemodificeerd. In het bijzonder worden materialen behandeld met metaalionen, polymeren, hydrofobe verbindingen en andere polyfunctionele middelen. In sommige gevallen wordt het medicijn zelf aangepast. Maar heel vaak leidt dit tot een afname van zijn activiteit.
Opname in de gel
Deze optie is vrij gebruikelijk vanwege zijn uniekheid en eenvoud. Deze methode is niet alleen geschikt voor individuele elementen, maar ook voor multi-enzymcomplexen. Opname in de gel kan op twee manieren gebeuren. In het eerste geval wordt het medicijn gecombineerd met een waterige oplossing van het monomeer, waarna polymerisatie wordt uitgevoerd. Als resultaat verschijnt er een ruimtelijke gelstructuur, die enzymmoleculen in de cellen bevat. In het tweede geval wordt het medicijn in de oplossing van het voltooide polymeer gebracht. Het wordt dan in gelvorm gebracht.
Intrusie in doorschijnende structuren
De essentie van deze immobilisatiemethode is de scheiding van een waterige enzymoplossing van het substraat. Hiervoor wordt een semi-permeabel membraan gebruikt. Het laat elementen met een laag molecuulgewicht van cofactoren en substraten door en houdt grote enzymen vast.
Micro-inkapseling
Er zijn verschillende opties voor inbedding in doorschijnende structuren. Hiervan zijn micro-inkapseling en opname van eiwitten in liposomen van het grootste belang. De eerste optie werd in 1964 voorgesteld door T. Chang. Het bestaat uit het feit dat de enzymoplossing wordt ingebracht in een gesloten capsule, waarvan de wanden zijn gemaakt van semi-permeabelepolymeer. Het verschijnen van een membraan op het oppervlak wordt veroorzaakt door de reactie van grensvlakpolycondensatie van verbindingen. Een ervan wordt opgelost in de organische en de andere - in de waterige fase. Een voorbeeld is de vorming van een microcapsule die wordt verkregen door polycondensatie van sebacinezuurhalogenide (organische fase) en hexamethyleendiamine-1,6 (respectievelijk waterige fase). De dikte van het membraan wordt berekend in honderdsten van een micrometer. De grootte van de capsules is honderden of tientallen micrometers.
Incorporatie in liposomen
Deze immobilisatiemethode ligt dicht bij micro-inkapseling. Liposomen worden gepresenteerd in lamellaire of bolvormige systemen van lipide dubbellagen. Deze methode werd voor het eerst gebruikt in 1970. Om liposomen te isoleren uit een lipide-oplossing, wordt het organische oplosmiddel verdampt. De resterende dunne film wordt gedispergeerd in een waterige oplossing waarin het enzym aanwezig is. Tijdens dit proces vindt zelfassemblage van lipide dubbellaagse structuren plaats. Dergelijke geïmmobiliseerde enzymen zijn behoorlijk populair in de geneeskunde. Dit komt door het feit dat de meeste moleculen zijn gelokaliseerd in de lipidenmatrix van biologische membranen. De geïmmobiliseerde enzymen in liposomen zijn het belangrijkste onderzoeksmateriaal in de geneeskunde, wat het mogelijk maakt om de patronen van vitale processen te bestuderen en te beschrijven.
Vorming van nieuwe obligaties
Immobilisatie door vorming van nieuwe covalente ketens tussen enzymen en dragers wordt beschouwd als de meest wijdverbreide methode voor het verkrijgen van industriële biokatalysatoren.bestemming. In tegenstelling tot fysieke methoden, zorgt deze optie voor een onomkeerbare en sterke binding tussen het molecuul en het materiaal. De vorming ervan gaat vaak gepaard met stabilisatie van het geneesmiddel. Tegelijkertijd veroorzaakt de locatie van het enzym op een afstand van de 1e covalente binding ten opzichte van de drager bepaalde moeilijkheden bij de implementatie van het katalytische proces. Door middel van een inzetstuk wordt het molecuul van het materiaal gescheiden. Het wordt vaak gebruikt als poly- en bifunctionele middelen. Dit zijn in het bijzonder hydrazine, cyanogeenbromide, glutaarzuur dialhedride, sulfurylchloride, enz. Om bijvoorbeeld galactosyltransferase te verwijderen, wordt de volgende sequentie ingevoegd tussen de drager en het enzym -CH2- NH-(CH 2)5-CO-. In een dergelijke situatie zijn een insert, een molecuul en een drager in de structuur aanwezig. Ze zijn allemaal verbonden door covalente bindingen. Van fundamenteel belang is de noodzaak om in de reactie functionele groepen te introduceren die niet essentieel zijn voor de katalytische functie van het element. Dus in de regel worden glycoproteïnen niet via het eiwit aan de drager gehecht, maar via het koolhydraatgedeelte. Als resultaat worden stabielere en actievere geïmmobiliseerde enzymen verkregen.
Cellen
De hierboven beschreven methoden worden als universeel beschouwd voor alle soorten biokatalysatoren. Deze omvatten onder andere cellen, subcellulaire structuren, waarvan de immobilisatie recentelijk wijdverbreid is geworden. Dit komt door het volgende. Wanneer cellen geïmmobiliseerd zijn, is het niet nodig om enzympreparaten te isoleren en te zuiveren of cofactoren in reacties te introduceren. Hierdoor wordt het mogelijk omsystemen die meertraps continue processen uitvoeren.
Gebruik van geïmmobiliseerde enzymen
In de diergeneeskunde, de industrie en andere economische sectoren zijn medicijnen die met de bovenstaande methoden zijn verkregen behoorlijk populair. In de praktijk ontwikkelde benaderingen bieden een oplossing voor de problemen van gerichte medicijnafgifte in het lichaam. Geïmmobiliseerde enzymen maakten het mogelijk om geneesmiddelen met een langdurige werking te verkrijgen met minimale allergeniciteit en toxiciteit. Momenteel lossen wetenschappers de problemen op die samenhangen met de bioconversie van massa en energie met behulp van microbiologische benaderingen. Ondertussen levert ook de technologie van geïmmobiliseerde enzymen een belangrijke bijdrage aan het werk. De vooruitzichten voor ontwikkeling lijken vrij breed te zijn. Dus in de toekomst zou een van de sleutelrollen in het proces van monitoring van de toestand van de omgeving moeten behoren tot nieuwe soorten analyses. In het bijzonder hebben we het over bioluminescente en enzym-immunoassay-methoden. Geavanceerde benaderingen zijn van bijzonder belang bij de verwerking van lignocellulose-grondstoffen. Geïmmobiliseerde enzymen kunnen worden gebruikt als zwakke signaalversterkers. Het actieve centrum kan onder invloed zijn van een drager die onder ultrageluid, mechanische stress staat of onderhevig is aan fytochemische transformaties.
