Eiwit is een essentieel onderdeel van alle organismen. Elk van zijn moleculen bestaat uit een of meer polypeptideketens die uit aminozuren bestaan. Hoewel de informatie die nodig is voor het leven is gecodeerd in DNA of RNA, vervullen recombinante eiwitten een breed scala aan biologische functies in organismen, waaronder enzymatische katalyse, bescherming, ondersteuning, beweging en regulering. Volgens hun functies in het lichaam kunnen deze stoffen worden onderverdeeld in verschillende categorieën, zoals antilichamen, enzymen, structurele componenten. Gezien hun belangrijke functies zijn dergelijke verbindingen intensief bestudeerd en op grote schaal gebruikt.
In het verleden was de belangrijkste manier om een recombinant eiwit te verkrijgen het isoleren van een natuurlijke bron, wat meestal inefficiënt en tijdrovend is. Recente ontwikkelingen in de biologische moleculaire technologie hebben het mogelijk gemaakt om DNA dat codeert voor een specifieke set stoffen te klonen in een expressievector voor stoffen zoals bacteriën, gisten, insectencellen en zoogdiercellen.
Simpel gezegd, recombinante eiwitten worden door exogene DNA-producten vertaald in:levende cellen. Het verkrijgen ervan omvat meestal twee hoofdstappen:
- Een molecuul klonen.
- Eiwitexpressie.
Momenteel is de productie van zo'n structuur een van de krachtigste methoden die in de geneeskunde en biologie worden gebruikt. De samenstelling heeft een brede toepassing in onderzoek en biotechnologie.
Medische richting
Recombinante eiwitten bieden belangrijke behandelingen voor verschillende ziekten zoals diabetes, kanker, infectieziekten, hemofilie en bloedarmoede. Typische formuleringen van dergelijke stoffen omvatten antilichamen, hormonen, interleukinen, enzymen en anticoagulantia. Er is een groeiende behoefte aan recombinante formuleringen voor therapeutisch gebruik. Hiermee kunt u de behandelmethoden uitbreiden.
genetisch gemanipuleerde recombinante eiwitten spelen een sleutelrol in de markt voor therapeutische geneesmiddelen. Zoogdiercellen produceren momenteel de meest therapeutische middelen omdat hun formuleringen in staat zijn om natuurlijke stoffen van hoge kwaliteit te produceren. Bovendien worden veel goedgekeurde recombinante therapeutische eiwitten geproduceerd in E. coli vanwege goede genetica, snelle groei en hoge productiviteit. Het heeft ook een positief effect op de ontwikkeling van medicijnen op basis van deze stof.
Onderzoek
Het verkrijgen van recombinante eiwitten is gebaseerd op verschillende methoden. Stoffen helpen om de basis- en fundamentele principes van het lichaam te ontdekken. Deze moleculen kunnen worden gebruikt om te identificeren en te bepalenlocatie van de stof die wordt gecodeerd door een bepaald gen, en om de functie van andere genen in verschillende cellulaire activiteiten te onthullen, zoals celsignalering, metabolisme, groei, replicatie en dood, transcriptie, translatie en modificatie van de verbindingen die in het artikel worden besproken.
De waargenomen samenstelling wordt dus vaak gebruikt in de moleculaire biologie, celbiologie, biochemie, structurele en biofysische studies en vele andere wetenschapsgebieden. Tegelijkertijd is het verkrijgen van recombinante eiwitten een internationale praktijk.
Dergelijke verbindingen zijn nuttige hulpmiddelen om intercellulaire interacties te begrijpen. Ze zijn effectief gebleken in verschillende laboratoriummethoden zoals ELISA en immunohistochemie (IHC). Recombinante eiwitten kunnen worden gebruikt om enzymassays te ontwikkelen. Wanneer ze worden gebruikt in combinatie met een paar geschikte antilichamen, kunnen cellen worden gebruikt als standaarden voor nieuwe technologieën.
Biotechnologie
Recombinante eiwitten die een aminozuursequentie bevatten, worden ook gebruikt in de industrie, voedselproductie, landbouw en bio-engineering. In de veehouderij kunnen bijvoorbeeld enzymen aan voedsel worden toegevoegd om de voedingswaarde van voederingrediënten te verhogen, kosten en afval te verminderen, de darmgezondheid van dieren te ondersteunen, de productiviteit te verbeteren en het milieu te verbeteren.
Bovendien melkzuurbacteriën (LAB) voor een lange tijdzijn gebruikt om gefermenteerd voedsel te produceren, en recentelijk is LAB ontwikkeld voor de expressie van recombinante eiwitten die een aminozuursequentie bevatten, die op grote schaal kunnen worden gebruikt, bijvoorbeeld om de spijsvertering van mens, dier en voeding te verbeteren.
Deze stoffen hebben echter ook beperkingen:
- In sommige gevallen is de productie van recombinante eiwitten complex, kostbaar en tijdrovend.
- Stoffen die in cellen worden geproduceerd, komen mogelijk niet overeen met natuurlijke vormen. Dit verschil kan de effectiviteit van therapeutische recombinante eiwitten verminderen en zelfs bijwerkingen veroorzaken. Bovendien kan dit verschil de resultaten van experimenten beïnvloeden.
- Het grootste probleem met alle recombinante geneesmiddelen is immunogeniciteit. Alle biotechproducten kunnen enige vorm van immunogeniciteit vertonen. Het is moeilijk om de veiligheid van nieuwe therapeutische eiwitten te voorspellen.
Over het algemeen zijn de vorderingen in de biotechnologie toegenomen en hebben ze de productie van recombinante eiwitten voor een verscheidenheid aan toepassingen vergemakkelijkt. Hoewel ze nog steeds enkele nadelen hebben, zijn de stoffen belangrijk in de geneeskunde, onderzoek en biotechnologie.
Ziektelink
recombinant eiwit is niet schadelijk voor de mens. Het is slechts een integraal onderdeel van het totale molecuul bij de ontwikkeling van een bepaald medicijn of voedingselement. Veel medische onderzoeken hebben aangetoond dat geforceerde expressie van het FGFBP3-eiwit (afgekort BP3) in een laboratoriumstam van zwaarlijvige muizen een significante vermindering van hun lichaamsvet liet zien.massa, ondanks de genetische aanleg om te gebruiken.
De resultaten van deze onderzoeken laten zien dat het FGFBP3-eiwit een nieuwe therapie kan bieden voor aandoeningen die verband houden met het metabool syndroom, zoals diabetes type 2 en leververvetting. Maar omdat BP3 een natuurlijk eiwit is en geen kunstmatig medicijn, kunnen klinische proeven met recombinant humaan BP3 beginnen na de laatste ronde van preklinische onderzoeken. Dat wil zeggen, er zijn redenen die verband houden met de veiligheid van het uitvoeren van dergelijke onderzoeken. Het recombinante eiwit is door de stapsgewijze verwerking en zuivering niet schadelijk voor de mens. Er vinden ook veranderingen plaats op moleculair niveau.
PD-L2, een van de belangrijkste spelers in immunotherapie, werd genomineerd voor de Nobelprijs voor de Fysiologie of Geneeskunde 2018. Dit werk, gestart door prof. James P. Allison uit de VS en prof. Tasuku Honjo uit Japan, heeft geleid tot de behandeling van kankers zoals melanoom, longkanker en andere op basis van checkpoint-immunotherapie. Onlangs heeft AMSBIO een belangrijk nieuw product toegevoegd aan zijn immunotherapielijn, de PD-L2/TCR-activator - CHO Recombinant Cell Line.
In proof-of-concept experimenten, onderzoekers van de Universiteit van Alabama in Birmingham, onder leiding van H. Long Zheng, MD, professor Robert B. Adams, en directeur van Laboratory Medicine, Department of Pathology, UAB School of Geneeskunde, hebben een potentiële therapie naar voren gebracht, een zeldzame maar dodelijke bloedingsstoornis, TTP.
De resultaten hiervanstudies tonen voor het eerst aan dat transfusie van met rADAMTS13 geladen bloedplaatjes een nieuwe en potentieel effectieve therapeutische benadering kan zijn voor arteriële trombose geassocieerd met congenitale en immuungemedieerde TTP.
Recombinant eiwit is niet alleen een voedingsstof, maar ook een medicijn in de samenstelling van het medicijn dat wordt ontwikkeld. Dit zijn slechts een paar gebieden die nu betrokken zijn bij de geneeskunde en die verband houden met de studie van al zijn structurele elementen. Zoals de internationale praktijk laat zien, maakt de structuur van een stof het op moleculair niveau mogelijk om veel ernstige problemen in het menselijk lichaam aan te pakken.
Vaccinontwikkeling
Een recombinant eiwit is een specifieke set moleculen die gemodelleerd kan worden. Een vergelijkbare eigenschap wordt gebruikt bij de ontwikkeling van vaccins. Een nieuwe vaccinatiestrategie, ook bekend als het gebruik van een speciale recombinante virusinjectie, zou miljoenen kippen kunnen beschermen die het risico lopen op een ernstige luchtwegaandoening, aldus onderzoekers van de Universiteit van Edinburgh en het Pirbright Institute. Deze vaccins gebruiken onschadelijke of zwakke versies van een virus of bacterie om ziektekiemen in de lichaamscellen te brengen. In dit geval gebruikten experts recombinante virussen met verschillende spike-eiwitten als vaccins om twee versies van een onschadelijk virus te maken. Er zijn veel verschillende medicijnen gebouwd rond deze verbinding.
Recombinant eiwit handelsnamen en analogen zijn als volgt:
- "Fortelizine".
- "Z altrap".
- "Eylea".
Dit zijn voornamelijk geneesmiddelen tegen kanker, maar er zijn andere behandelingsgebieden die verband houden met deze werkzame stof.
Een nieuw vaccin, ook wel LASSARAB genoemd, ontworpen om mensen te beschermen tegen zowel lassakoorts als hondsdolheid, heeft veelbelovende resultaten opgeleverd in preklinische onderzoeken, volgens een nieuwe studie gepubliceerd in het wetenschappelijke tijdschrift Nature Communications. Een geïnactiveerd recombinant vaccinkandidaat gebruikt een verzwakt rabiësvirus.
Het onderzoeksteam bracht genetisch materiaal van het Lassa-virus in een rabiësvirusvector in, zodat het vaccin oppervlakte-eiwitten tot expressie zou brengen in zowel Lassa- als rabiëscellen. Deze oppervlakteverbindingen wekken een immuunrespons op tegen infectieuze agentia. Dit vaccin werd vervolgens geïnactiveerd om het levende rabiësvirus dat werd gebruikt om de drager te maken, te "vernietigen".
Methoden ophalen
Er zijn verschillende systemen om een stof te produceren. De algemene methode voor het verkrijgen van een recombinant eiwit is gebaseerd op het verkrijgen van biologisch materiaal uit de synthese. Maar er zijn andere manieren.
Momenteel zijn er vijf hoofdexpressiesystemen:
- E. coli-expressiesysteem.
- Gistexpressiesysteem.
- Insectencelexpressiesysteem.
- Zoogdiercelexpressiesysteem.
- Celvrij eiwit-expressiesysteem.
De laatste optie is bijzonder geschikt voor de expressie van transmembraaneiwittenen giftige verbindingen. In de afgelopen jaren zijn stoffen die moeilijk tot expressie kunnen worden gebracht met conventionele intracellulaire methoden met succes in cellen in vitro geïntegreerd. In Wit-Rusland wordt de productie van recombinante eiwitten veel gebruikt. Er zijn een aantal staatsbedrijven die met dit probleem te maken hebben.
Cell Free Protein Synthesis System is een snelle en efficiënte methode voor het synthetiseren van doelstoffen door verschillende substraten en energieverbindingen toe te voegen die nodig zijn voor transcriptie en translatie in het enzymatische systeem van cellulaire extracten. In de afgelopen jaren zijn de voordelen van celvrije methoden voor soorten stoffen zoals complexe, giftige membranen geleidelijk naar voren gekomen, wat hun potentiële toepassing op biofarmaceutisch gebied aantoont.
Celvrije technologie kan een verscheidenheid aan niet-natuurlijk voorkomende aminozuren gemakkelijk en op een gecontroleerde manier toevoegen om complexe modificatieprocessen te bereiken die moeilijk op te lossen zijn na conventionele recombinante expressie. Dergelijke werkwijzen hebben een hoge toepassingswaarde en potentieel voor medicijnafgifte en vaccinontwikkeling met gebruikmaking van virusachtige deeltjes. Een groot aantal membraaneiwitten is met succes tot expressie gebracht in vrije cellen.
Expressie van composities
Recombinant eiwit CFP10-ESAT 6 wordt geproduceerd en gebruikt om vaccins te maken. Met zo'n tuberculose-allergeen kunt u het immuunsysteem versterken en antilichamen ontwikkelen. In het algemeen omvatten moleculaire studies de studie van elk aspect van een eiwit, zoals structuur, functie, modificaties, lokalisatie of interacties. Ontdekkenhoe specifieke stoffen interne processen reguleren, hebben onderzoekers meestal de middelen nodig om functionele verbindingen van belang en voordeel te produceren.
Gezien de omvang en complexiteit van eiwitten, is chemische synthese geen haalbare optie voor dit streven. In plaats daarvan worden levende cellen en hun cellulaire machinerie meestal gebruikt als fabrieken om stoffen te creëren en te construeren op basis van de verstrekte genetische sjablonen. Het recombinante eiwitexpressiesysteem genereert vervolgens de noodzakelijke structuur om een medicijn te creëren. Vervolgens komt de selectie van het benodigde materiaal voor verschillende categorieën medicijnen.
In tegenstelling tot eiwitten is DNA gemakkelijk synthetisch of in vitro te construeren met behulp van gevestigde recombinante technieken. Daarom kunnen DNA-templates van specifieke genen, met of zonder toegevoegde reportersequenties of affiniteitstag-sequenties, worden ontworpen als templates voor expressie van de gecontroleerde stof. Dergelijke verbindingen die van dergelijke DNA-templates zijn afgeleid, worden recombinante eiwitten genoemd.
Traditionele strategieën voor expressie van een stof omvatten het transfecteren van cellen met een DNA-vector die een sjabloon bevat en het vervolgens kweken van de cellen om het gewenste eiwit te transcriberen en te vertalen. Gewoonlijk worden de cellen vervolgens gelyseerd om de tot expressie gebrachte verbinding te extraheren voor daaropvolgende zuivering. Het recombinante eiwit CFP10-ESAT6 wordt op deze manier verwerkt en gaat door een zuiveringssysteem van mogelijkde vorming van toxines. Pas daarna wordt het gesynthetiseerd tot een vaccin.
Zowel prokaryote als eukaryote in vivo expressiesystemen voor moleculaire stoffen worden veel gebruikt. De keuze van het systeem hangt af van het type eiwit, de behoefte aan functionele activiteit en de gewenste opbrengst. Deze expressiesystemen omvatten zoogdieren, insecten, gisten, bacteriën, algen en cellen. Elk systeem heeft zijn eigen voordelen en uitdagingen, en het kiezen van het juiste systeem voor een bepaalde toepassing is belangrijk voor de succesvolle expressie van de onderzochte stof.
Expressie van zoogdieren
Het gebruik van recombinante eiwitten maakt de ontwikkeling van vaccins en medicijnen van verschillende niveaus mogelijk. Hiervoor kan deze methode voor het verkrijgen van een stof worden gebruikt. Zoogdierexpressiesystemen kunnen worden gebruikt om eiwitten uit het dierenrijk te produceren die de meest natuurlijke structuur en activiteit hebben vanwege hun fysiologisch relevante omgeving. Dit resulteert in hoge niveaus van post-translationele verwerking en functionele activiteit. Zoogdierexpressiesystemen kunnen worden gebruikt om antilichamen, complexe eiwitten en verbindingen te produceren voor gebruik in celgebaseerde functionele testen. Deze voordelen gaan echter gepaard met strengere kweekvoorwaarden.
Zoogdierexpressiesystemen kunnen worden gebruikt om eiwitten tijdelijk of via stabiele cellijnen te genereren waarbij het expressieconstruct is geïntegreerd in het gastheergenoom. Hoewel dergelijke systemen in meerdere experimenten kunnen worden gebruikt, is de tijdproductie kan in één tot twee weken een grote hoeveelheid stof genereren. Er is veel vraag naar dit type recombinante eiwitbiotechnologie.
Deze tijdelijke, hoogproductieve zoogdierexpressiesystemen gebruiken suspensieculturen en kunnen gram per liter opleveren. Bovendien hebben deze eiwitten meer natieve vouwing en post-translationele modificaties zoals glycosylering in vergelijking met andere expressiesystemen.
Insectenexpressie
Methoden voor het produceren van recombinant eiwit zijn niet beperkt tot zoogdieren. Er zijn ook productievere manieren in termen van productiekosten, hoewel de opbrengst van de stof per 1 liter behandelde vloeistof veel lager is.
Insectencellen kunnen worden gebruikt om een eiwit op hoog niveau tot expressie te brengen met modificaties die vergelijkbaar zijn met zoogdiersystemen. Er zijn verschillende systemen die kunnen worden gebruikt om recombinant baculovirus te genereren, dat vervolgens kan worden gebruikt om de betreffende stof in insectencellen te extraheren.
Expressies van recombinante eiwitten kunnen eenvoudig worden opgeschaald en aangepast aan een suspensiecultuur met hoge dichtheid voor grootschalige bereiding van moleculen. Ze zijn meer functioneel vergelijkbaar met de oorspronkelijke samenstelling van zoogdieren. Hoewel de opbrengst tot 500 mg/L kan zijn, kan de productie van recombinant baculovirus tijdrovend zijn en de kweekomstandigheden zijn moeilijker dan prokaryotische systemen. In meer zuidelijke en warmere landen is echter een vergelijkbaremethode wordt als efficiënter beschouwd.
Bacteriële expressie
De productie van recombinante eiwitten kan worden vastgesteld met behulp van bacteriën. Deze technologie verschilt sterk van de hierboven beschreven. Bacteriële eiwitexpressiesystemen zijn populair omdat de bacteriën gemakkelijk te kweken zijn, snel groeien en hoge opbrengsten van de recombinante formulering opleveren. Echter, multidomein eukaryote stoffen die tot expressie worden gebracht in bacteriën zijn vaak niet-functioneel omdat cellen niet zijn uitgerust om de noodzakelijke post-translationele modificaties of moleculaire vouwing uit te voeren.
Bovendien worden veel eiwitten onoplosbaar als inclusiemoleculen, die erg moeilijk te herstellen zijn zonder agressieve denaturatoren en de daaropvolgende omslachtige moleculaire hervouwingsprocedures. Deze methode wordt meestal als nog grotendeels experimenteel beschouwd.
Cell vrije meningsuiting
Recombinant eiwit dat de aminozuursequentie van staphylokinase bevat, wordt op een iets andere manier verkregen. Het is opgenomen in vele soorten injecties, waarvoor verschillende systemen nodig zijn voor gebruik.
Celvrije eiwitexpressie is een in vitro synthese van een stof met behulp van translationeel compatibele extracten van hele cellen. In principe bevatten extracten van hele cellen alle macromoleculen en componenten die nodig zijn voor transcriptie, translatie en zelfs post-translationele modificatie.
Deze componenten omvatten RNA-polymerase, regulerende eiwitfactoren, transcriptievormen, ribosomen en tRNA. Bij het toevoegencofactoren, nucleotiden en een specifieke gensjabloon, deze extracten kunnen in een paar uur interessante eiwitten synthetiseren.
Hoewel niet duurzaam voor grootschalige productie, bieden celvrije of in vitro eiwitexpressie (IVT) systemen een aantal voordelen ten opzichte van conventionele in vivo systemen.
Celvrije expressie maakt snelle synthese van recombinante formuleringen mogelijk zonder celkweek. Celvrije systemen maken het mogelijk om eiwitten te labelen met gemodificeerde aminozuren, evenals om verbindingen tot expressie te brengen die snelle proteolytische afbraak ondergaan door intracellulaire proteasen. Bovendien is het gemakkelijker om veel verschillende eiwitten tegelijkertijd tot expressie te brengen met behulp van een celvrije methode (bijvoorbeeld het testen van eiwitmutaties door kleinschalige expressie van veel verschillende recombinante DNA-templates). In dit representatieve experiment werd het IVT-systeem gebruikt om het menselijke caspase-3-eiwit tot expressie te brengen.
Conclusies en toekomstperspectieven
Recombinante eiwitproductie kan nu worden gezien als een volwassen discipline. Dit is het resultaat van talrijke stapsgewijze verbeteringen in zuivering en analyse. Momenteel worden programma's voor het ontdekken van geneesmiddelen zelden stopgezet vanwege het onvermogen om het doeleiwit te produceren. Parallelle processen voor de expressie, zuivering en analyse van verschillende recombinante stoffen zijn nu algemeen bekend in vele laboratoria over de hele wereld.
Eiwitcomplexen en groeiend succes bij het makenopgeloste membraanstructuren zullen meer veranderingen vereisen om de vraag bij te houden. De opkomst van effectieve contractonderzoeksorganisaties voor een meer regelmatige aanvoer van eiwitten zal de hertoewijzing van wetenschappelijke middelen mogelijk maken om deze nieuwe uitdagingen aan te gaan.
Bovendien moeten parallelle workflows het mogelijk maken om volledige bibliotheken van de gecontroleerde stof te creëren om nieuwe doelwitidentificatie en geavanceerde screening mogelijk te maken, samen met traditionele projecten voor het ontdekken van geneesmiddelen met kleine moleculen.
