Absorptie en verdere heremissie van licht door anorganische en organische media is het resultaat van fosforescentie of fluorescentie. Het verschil tussen de verschijnselen is de lengte van het interval tussen lichtabsorptie en emissie van de stroom. Bij fluorescentie vinden deze processen bijna gelijktijdig plaats, en bij fosforescentie, met enige vertraging.
Historische achtergrond
In 1852 beschreef de Britse wetenschapper Stokes voor het eerst fluorescentie. Hij bedacht de nieuwe term als resultaat van zijn experimenten met vloeispaat, dat rood licht uitstraalde bij blootstelling aan ultraviolet licht. Stokes merkte een interessant fenomeen op. Hij ontdekte dat de golflengte van fluorescerend licht altijd langer is dan die van het excitatielicht.
Er zijn in de 19e eeuw veel experimenten uitgevoerd om de hypothese te bevestigen. Ze toonden aan dat verschillende monsters fluoresceren bij blootstelling aan ultraviolet licht. Materialen waren onder andere kristallen, harsen, mineralen, chlorofyl,medicinale grondstoffen, anorganische verbindingen, vitamines, oliën. Het directe gebruik van kleurstoffen voor biologische analyse begon pas in 1930
Fluorescentiemicroscopie beschrijving
Sommige van de materialen die in de eerste helft van de 20e eeuw bij onderzoek werden gebruikt, waren zeer specifiek. Dankzij indicatoren die niet konden worden bereikt met contrastmethoden, is de fluorescentiemicroscopiemethode een belangrijk hulpmiddel geworden in zowel biomedisch als biologisch onderzoek. De verkregen resultaten waren van niet gering belang voor de materiaalkunde.
Wat zijn de voordelen van fluorescentiemicroscopie? Met behulp van nieuwe materialen werd het mogelijk om zeer specifieke cellen en submicroscopische componenten te isoleren. Met een fluorescentiemicroscoop kun je individuele moleculen detecteren. Met een verscheidenheid aan kleurstoffen kunt u verschillende elementen tegelijkertijd identificeren. Hoewel de ruimtelijke resolutie van de apparatuur wordt beperkt door de diffractielimiet, die op zijn beurt afhangt van de specifieke eigenschappen van het monster, is de detectie van moleculen onder dit niveau ook goed mogelijk. Verschillende monsters vertonen autofluorescentie na bestraling. Dit fenomeen wordt veel gebruikt in de petrologie, botanie, halfgeleiderindustrie.
Kenmerken
De studie van dierlijke weefsels of pathogene micro-organismen wordt vaak bemoeilijkt door ofwel een te zwakke of zeer sterke niet-specifieke autofluorescentie. De waarde inonderzoek verwerft de introductie in het materiaal van componenten die op een specifieke golflengte worden geëxciteerd en een lichtstroom van de vereiste intensiteit uitzenden. Fluorochromen fungeren als kleurstoffen die in staat zijn zichzelf te hechten aan structuren (onzichtbaar of zichtbaar). Tegelijkertijd onderscheiden ze zich door een hoge selectiviteit met betrekking tot doelen en kwantumopbrengst.
Fluorescentiemicroscopie is op grote schaal gebruikt met de komst van natuurlijke en synthetische kleurstoffen. Ze hadden specifieke emissie- en excitatie-intensiteitsprofielen en waren gericht op specifieke biologische doelen.
Identificatie van individuele moleculen
Vaak kun je onder ideale omstandigheden de gloed van een enkel element registreren. Hiervoor is het onder andere noodzakelijk om te zorgen voor voldoende lage detectorruis en optische achtergrond. Een fluoresceïnemolecuul kan tot 300.000 fotonen uitzenden voordat het wordt vernietigd door fotobleken. Met een inzamelingspercentage van 20% en procesefficiëntie kunnen ze worden geregistreerd voor een bedrag van ongeveer 60 duizend
Fluorescentiemicroscopie, gebaseerd op lawinefotodiodes of elektronenvermenigvuldiging, stelde onderzoekers in staat het gedrag van individuele moleculen seconden, en in sommige gevallen minuten, te observeren.
Moeilijkheden
Het belangrijkste probleem is ruisonderdrukking van de optische achtergrond. Omdat veel van de materialen die worden gebruikt bij de constructie van filters en lenzen enige autofluorescentie vertonen, waren de inspanningen van wetenschappers in de beginfase gericht op het uitgeven vancomponenten met een lage fluorescentie. Latere experimenten leidden echter tot nieuwe conclusies. In het bijzonder is gevonden dat fluorescentiemicroscopie op basis van totale interne reflectie een lage achtergrond- en hoge excitatielichtopbrengst oplevert.
Mechanisme
De principes van fluorescentiemicroscopie op basis van totale interne reflectie zijn het gebruik van een snel afnemende of niet-propagerende golf. Het ontstaat op het grensvlak tussen media met verschillende brekingsindices. In dit geval gaat de lichtstraal door een prisma. Het heeft een hoge brekingsindex.
Het prisma grenst aan een waterige oplossing of glas met een lage parameterwaarde. Als de lichtstraal erop wordt gericht onder een hoek die groter is dan de kritische, wordt de straal volledig gereflecteerd vanaf het grensvlak. Dit fenomeen geeft op zijn beurt aanleiding tot een zich niet voortplantende golf. Met andere woorden, er wordt een elektromagnetisch veld gegenereerd dat een medium met een lagere brekingsindex binnendringt op een afstand van minder dan 200 nanometer.
In een zich niet voortplantende golf zal de lichtintensiteit voldoende zijn om fluoroforen op te wekken. Vanwege de uitzonderlijk geringe diepte zal het volume echter erg klein zijn. Het resultaat is een achtergrond op laag niveau.
Wijziging
Fluorescentiemicroscopie op basis van totale interne reflectie kan worden gerealiseerd met epi-verlichting. Dit vereist lenzen met een grotere numerieke apertuur (ten minste 1,4, maar het is wenselijk dat deze 1,45-1,6) bereikt, evenals een gedeeltelijk verlicht veld van het apparaat. Dit laatste wordt bereikt met een kleine vlek. Voor meer uniformiteit wordt een dunne ring gebruikt, waardoor een deel van de stroming wordt geblokkeerd. Om een kritische hoek te verkrijgen waarna totale reflectie optreedt, is een hoge mate van breking van het immersiemedium in de lenzen en het dekglas van de microscoop nodig.