De moderne biologie verbaast zich over het unieke karakter en de omvang van haar ontdekkingen. Tegenwoordig bestudeert deze wetenschap de meeste processen die voor onze ogen verborgen zijn. Dit is opmerkelijk voor de moleculaire biologie - een van de veelbelovende gebieden die helpt om de meest complexe mysteries van levende materie te ontrafelen.
Wat is omgekeerde transcriptie
Reverse transcriptie (kortweg RT) is een specifiek proces dat kenmerkend is voor de meeste RNA-virussen. Het belangrijkste kenmerk is de synthese van een dubbelstrengs DNA-molecuul op basis van boodschapper-RNA.
OT is niet kenmerkend voor bacteriën of eukaryote organismen. Het belangrijkste enzym, reversetase, speelt een sleutelrol bij de synthese van dubbelstrengs DNA.
Ontdekkingsgeschiedenis
Het idee dat een ribonucleïnezuurmolecuul een sjabloon voor DNA-synthese zou kunnen worden, werd tot de jaren zeventig als absurd beschouwd. Toen ontdekten B altimore en Temin, die afzonderlijk van elkaar werkten, bijna gelijktijdig een nieuw enzym. Ze noemden het RNA-afhankelijke DNA-polymerase of reverse transcriptase.
De ontdekking van dit enzym bevestigde onvoorwaardelijk het bestaan van organismenin staat tot reverse transcriptie. Beide wetenschappers ontvingen in 1975 de Nobelprijs. Na enige tijd stelde Engelhardt een alternatieve naam voor reverse transcriptase voor - revertase.
Waarom OT in tegenspraak is met het centrale dogma van de moleculaire biologie
Het centrale dogma is het concept van sequentiële eiwitsynthese in elke levende cel. Zo'n schema is opgebouwd uit drie componenten: DNA, RNA en eiwit.
Volgens het centrale dogma kan RNA uitsluitend op de DNA-template worden gesynthetiseerd, en alleen dan is RNA betrokken bij de opbouw van de primaire structuur van het eiwit.
Dit dogma werd officieel aanvaard in de wetenschappelijke gemeenschap vóór de ontdekking van reverse transcriptie. Het is niet verrassend dat het idee van omgekeerde synthese van DNA uit RNA al lang door wetenschappers is afgewezen. Pas in 1970, samen met de ontdekking van reversetase, kwam er een einde aan dit probleem, wat tot uiting kwam in het concept van eiwitsynthese.
Revertase van aviaire retrovirussen
Het proces van reverse transcriptie is niet compleet zonder de deelname van RNA-afhankelijk DNA-polymerase. Revertase van het aviaire retrovirus is tot op heden maximaal onderzocht.
Er zijn slechts ongeveer 40 moleculen van dit eiwit te vinden in één virion van deze familie van virussen. Het eiwit bestaat uit twee subeenheden die in gelijke aantallen zijn en drie belangrijke functies van reversease vervullen:
1) Synthese van een DNA-molecuul zowel op een enkelstrengs/dubbelstrengs RNA-template als op basis van deoxyribonucleïnezuren.
2) RNase H-activering, waarvan de belangrijkste rol is omsplitsing van het RNA-molecuul in het RNA-DNA-complex.
3) Vernietiging van secties van DNA-moleculen voor insertie in het eukaryote genoom.
Mechanisme OT
De stappen voor omgekeerde transcriptie kunnen variëren, afhankelijk van de familie van virussen, d.w.z. op het type van hun nucleïnezuren.
Laten we eerst eens kijken naar die virussen die reversetase gebruiken. Hier is het OT-proces verdeeld in 3 stappen:
1) Synthese van de "-" RNA-streng op de sjabloon "+" van de RNA-streng.
2) Vernietiging van de "+"-streng van RNA in het RNA-DNA-complex met behulp van het enzym RNase H.
3) Synthese van een dubbelstrengs DNA-molecuul op de template "-" van de RNA-keten.
Deze methode van virionreproductie is typisch voor sommige oncogene virussen en het humaan immunodeficiëntievirus (hiv).
Het is vermeldenswaard dat voor de synthese van elk nucleïnezuur op een RNA-sjabloon, een zaadje of primer nodig is. Een primer is een korte sequentie van nucleotiden die complementair is aan het 3'-uiteinde van een RNA-molecuul (sjabloon) en een belangrijke rol speelt bij het initiëren van de synthese.
Wanneer kant-en-klare dubbelstrengs DNA-moleculen van virale oorsprong worden geïntegreerd in het eukaryote genoom, begint het gebruikelijke mechanisme van virion-eiwitsynthese. Als gevolg hiervan wordt de cel die door het virus wordt 'gevangen' een fabriek voor de productie van virionen, waar de benodigde eiwit- en RNA-moleculen in grote hoeveelheden worden gevormd.
Een andere manier van reverse transcriptie is gebaseerd op de werking van RNA-synthetase. Dit eiwit is actief in paramyxovirussen, rhabdovirussen, picornovirussen. In dit geval is er geen derde fase van OT - de formatiedubbelstrengs DNA, en in plaats daarvan wordt een "+" RNA-keten gesynthetiseerd op de sjabloon van de virale "-" RNA-keten en vice versa.
De herhaling van dergelijke cycli leidt zowel tot de replicatie van het virusgenoom als tot de vorming van mRNA dat in staat is tot eiwitsynthese onder de omstandigheden van een geïnfecteerde eukaryote cel.
Biologische betekenis van reverse transcriptie
Het OT-proces is van het grootste belang in de levenscyclus van veel virussen (voornamelijk retrovirussen zoals HIV). Het RNA van een virion dat een eukaryote cel aanviel, wordt een sjabloon voor de synthese van de eerste DNA-streng, waarop het niet moeilijk is om de tweede streng te voltooien.
Het verkregen dubbelstrengs DNA van het virus is geïntegreerd in het eukaryote genoom, wat leidt tot de activering van de processen van virion-eiwitsynthese en het verschijnen van een groot aantal van zijn kopieën in de geïnfecteerde cel. Dit is de belangrijkste missie van Revertase en OT in het algemeen voor het virus.
Reverse transcriptie kan ook voorkomen bij eukaryoten in de context van retrotransposons - mobiele genetische elementen die onafhankelijk van het ene deel van het genoom naar het andere kunnen worden getransporteerd. Dergelijke elementen hebben volgens wetenschappers de evolutie van levende organismen veroorzaakt.
Retrotransposon is een stuk eukaryoot DNA dat codeert voor verschillende eiwitten. Een daarvan, reversetase, is direct betrokken bij de delokalisatie van dergelijke retrotransporozon.
Gebruik van OT in de wetenschap
Sinds het moment waarop reversetase in zijn pure vorm werd geïsoleerd, werd het proces van reverse transcriptie overgenomen door biologen. De studie van het OT-mechanisme helpt nog steeds om de sequenties van de belangrijkste menselijke eiwitten te lezen.
Het feit is dat het genoom van eukaryoten, inclusief ons, niet-informatieve regio's bevat die introns worden genoemd. Wanneer een nucleotidesequentie van dergelijk DNA wordt afgelezen en een enkelstrengs RNA wordt gevormd, verliest het laatste introns en codeert het uitsluitend voor eiwit. Als DNA wordt gesynthetiseerd met behulp van reversetase op een RNA-sjabloon, dan is het gemakkelijk om het te sequensen en de volgorde van de nucleotiden te achterhalen.
Nucleïnezuur dat is gevormd door reverse transcriptase, wordt cDNA genoemd. Het wordt vaak gebruikt in de polymerasekettingreactie (PCR) om het aantal kopieën van de resulterende cDNA-kopie kunstmatig te verhogen. Deze methode wordt niet alleen in de wetenschap gebruikt, maar ook in de geneeskunde: laboratoriumassistenten bepalen de gelijkenis van dergelijk DNA met de genomen van verschillende bacteriën of virussen uit een gemeenschappelijke bibliotheek. De synthese van vectoren en hun introductie in bacteriën is een van de veelbelovende gebieden van de biologie. Als RT wordt gebruikt om het DNA van mensen en andere organismen zonder introns te vormen, kunnen dergelijke moleculen gemakkelijk in het bacteriële genoom worden geïntroduceerd. Dus de laatste worden fabrieken voor de productie van stoffen die nodig zijn voor een persoon (bijvoorbeeld enzymen).
