Moleculair biologische onderzoeksmethoden spelen een grote rol in de moderne geneeskunde, forensisch onderzoek en biologie. Dankzij de vooruitgang in de studie van DNA en RNA kan een persoon het genoom van een organisme bestuderen, de veroorzaker van een ziekte bepalen, het gewenste nucleïnezuur herkennen in een mengsel van zuren, enz.
Moleculair biologische onderzoeksmethoden. Wat is het?
In de jaren 70 en 80 slaagden wetenschappers er voor het eerst in om het menselijk genoom te ontcijferen. Dit evenement gaf een impuls aan de ontwikkeling van genetische manipulatie en moleculaire biologie. De studie van de eigenschappen van DNA en RNA heeft ertoe geleid dat het nu mogelijk is om deze nucleïnezuren te gebruiken om een ziekte te diagnosticeren, genen te bestuderen.
Het verkrijgen van DNA en RNA
Moleculaire biologische diagnostische methoden vereisen de aanwezigheid van uitgangsmateriaal: vaker zijn het nucleïnezuren. Er zijn verschillende manieren om deze stoffen uit de cellen van levende organismen te isoleren. Elk van hen heeft zijn eigen voor- en nadelen, en het is noodzakelijkrekening mee houden bij het kiezen van een methode voor het isoleren van zuivere nucleïnezuren.
1. DNA verkrijgen volgens Marmur. De methode bestaat uit het behandelen van een mengsel van stoffen met alcohol, waardoor zuiver DNA neerslaat. Het nadeel van deze methode is het gebruik van agressieve stoffen: fenol en chloroform.
2. Isolatie van DNA volgens Boom. De belangrijkste stof die hier wordt gebruikt is guanidinethiocyanaat (GuSCN). Het draagt bij aan de precipitatie van deoxyribonucleïnezuur op gespecialiseerde substraten, waaruit het vervolgens kan worden verzameld met een speciale buffer. GuSCN is echter een remmer van PTC, en zelfs een klein deel ervan dat in het geprecipiteerde DNA terechtkomt, kan het verloop van de polymerasekettingreactie beïnvloeden, die een belangrijke rol speelt bij het werken met nucleïnezuren.
3. Sedimentatie van onzuiverheden. De methode verschilt van de vorige doordat het niet de moleculen van desoxyribonucleïnezuur zijn die worden neergeslagen, maar onzuiverheden. Hiervoor worden ionenwisselaars gebruikt. Het nadeel is dat niet alle stoffen kunnen neerslaan.
4. Massa-screening. Deze methode wordt gebruikt in gevallen waarin exacte informatie over de samenstelling van het DNA-molecuul niet nodig is, maar het wel nodig is om enkele statistische gegevens te verkrijgen. Dit wordt verklaard door het feit dat de structuur van het nucleïnezuur kan worden beschadigd wanneer het wordt behandeld met detergentia, in het bijzonder alkaliën.
Classificatie van onderzoeksmethoden
Alle moleculair biologische onderzoeksmethoden zijn onderverdeeld in drie grote groepen:
1. Amplificatie (met behulp van veel enzymen). Hierverwijst naar PCR - polymerasekettingreactie, die een grote rol speelt in veel van de diagnostische methoden.
2. Niet-versterkend. Deze groep methoden is direct gerelateerd aan de werking van mengsels van nucleïnezuren. Voorbeelden zijn 3 blots, in situ hybridisatie, enz.
3. Methoden gebaseerd op de herkenning van een signaal van een probemolecuul dat bindt aan een specifiek probe-DNA of -RNA. Een voorbeeld is het Hybride Capture System (hc2).
Enzymen die kunnen worden gebruikt in onderzoeksmethoden in de moleculaire biologie
Bij veel moleculaire diagnostische methoden wordt een breed scala aan enzymen gebruikt. Hieronder staan de meest gebruikte:
1. Restrictie-enzym - "knipt" het DNA-molecuul in de noodzakelijke delen.
2. DNA-polymerase - synthetiseert een dubbelstrengs molecuul van deoxyribonucleïnezuur.
3. Reverse transcriptase (revertase) - gebruikt om DNA te synthetiseren op een RNA-sjabloon.
4. DNA-ligase - verantwoordelijk voor de vorming van fosfodiesterbindingen tussen nucleotiden.
5. Exonuclease - verwijdert nucleotiden van de terminale secties van het deoxyribonucleïnezuurmolecuul.
PCR is de belangrijkste methode voor DNA-amplificatie
Polymerasekettingreactie (PCR) wordt actief gebruikt in de moderne moleculaire biologie. Dit is een methode waarbij een enorm aantal kopieën kan worden verkregen uit een enkel DNA-molecuul (moleculen worden geamplificeerd).
Belangrijkste functies van PCR:
- diagnostiekziekten;
- klonen van DNA-segmenten, genen.
De volgende elementen zijn nodig om een polymerasekettingreactie uit te voeren: het initiële DNA-molecuul, een thermostabiel DNA-polymerase (Taq of Pfu), deoxyribonucleotidefosfaten (bronnen van stikstofbasen), primers (2 primers per 1 DNA-molecuul) en het buffersysteem zelf, waarin alle reacties mogelijk zijn.
PCR bestaat uit drie stappen: denaturatie, primer-annealing en elongatie.
1. Denaturatie. Bij een temperatuur van 94-95 graden Celsius worden de waterstofbruggen tussen de twee DNA-strengen verbroken, en als resultaat krijgen we twee enkelstrengs moleculen.
2. Primer gloeien. Bij een temperatuur van 50-60 graden Celsius worden primers door het type complementariteit aan de uiteinden van enkelstrengs nucleïnezuurmoleculen gehecht.
3. Verlenging. Bij een temperatuur van 72 graden vindt de synthese van dubbelstrengs dochtermoleculen van deoxyribonucleïnezuur plaats.
DNA-sequencing
Moleculair biologische onderzoeksmethoden vereisen vaak kennis van de nucleotidesequentie in een deoxyribonucleïnezuurmolecuul. Sequentie wordt uitgevoerd om de genetische code te bepalen. De moleculaire diagnostiek van de toekomst zal gebaseerd zijn op kennis die is opgedaan met menselijke sequencing.
De volgende soorten sequencing worden onderscheiden:
- Maxam-Gilbert-sequencing;
- Sanger-sequencing;
- pyrosequencing;
- nanoporsequencing.
