Bij de differentiële bepaling van enterobacteriën en sommige vibrios neemt de Voges-Proskauer-reactie een speciale plaats in. De test is gebaseerd op het vermogen van bacteriën om glucose te fermenteren om acetoïne te vormen.
De essentie van het onderzoeksproces
In de microbiologie wordt de Voges-Proskauer-reactie vaak gebruikt om onderscheid te maken binnen de Yersinia-familie van enterobacteriën (inclusief de pathogenen van pseudotuberculose en enterocolitis), Escherichia coli en sporenvormende aeroben. Het resultaat wordt gevisualiseerd door het medium te kleuren wanneer bepaalde reagentia worden toegevoegd.
Deze test behoort tot de IMViC-serie (afkorting van Indol, Methyl Red, Voges-Proskauer i Citrate) - een groep identificatietests inclusief differentiële definities:
- met indool, gebaseerd op de afbraak van tryptofaan tot indol, gebruikt in aanwezigheid van een Kovacs- of Ehrlich-reagens;
- gebruikenmethylroth, of methylrood, dat een bepaalde pH detecteert als gevolg van glucosemetabolisatie;
- Voges-Proskauer reacties voor de detectie van acetyl-methylcarbinol;
- gebruik van citraat met kleurverandering als gevolg van alkalisering van het medium.
De essentie van het proces is de visualisatie van de aanwezigheid van gediagnosticeerde bacteriën als gevolg van de interactie van de door hen gevormde acetoïne met kaliloog in aanwezigheid van zuurstof. Acetyl-methylcarbinol wordt geoxideerd tot diacetyl, dat een helderrode of roze verbinding vormt. Verhoog de gevoeligheid van de test door alfa-naftol te introduceren voordat u bijtende potas toevoegt.
Testinstelling
De formulering van de Voges-Proskauer-reactie omvat de voorlopige kweek van micro-organismen. Een zuivere cultuur wordt gezaaid op Clark's differentieel diagnostisch medium, een variant daarvan is Clark's bouillon (zonder toevoeging van agar-agar). Ofwel kant-en-klaar medium wordt gebruikt of onafhankelijk bereid. Ingrediënten zijn onder meer:
- 5g pepton;
- 5g glucose;
- 5g dibasisch kaliumfosfaat;
- 1L destillaat.
Tijdens het onderzoek wordt de cultuur geënt met een steriele bacteriologische lus in een vloeibaar medium. Hoeveelheid - 5 ml in een reageerbuis plus controle. Incubatie wordt gedurende twee dagen uitgevoerd bij een temperatuur van 35-37 graden. Vervolgens wordt een studie van de Voges-Proskauer-reactie in fasen uitgevoerd:
- 2, 5 ml bouilloncultuur wordt overgebracht naar een steriele buis.
- Voeg zes druppels alfa-naftol (5% alcoholoplossing) toe.
- Voeg 40% toeeen oplossing van bijtend kalium in een hoeveelheid van 0,1 ml, of twee druppels.
- Het roeren wordt uitgevoerd door de reageerbuis zachtjes te schudden.
- Evalueer het resultaat 15 minuten vanaf het begin van het experiment.
Een alternatieve testmethode is incubatie gedurende de nacht, waarvan de tijd wordt teruggebracht tot 18 uur of maximaal een dag. Naast deze methode wordt ook een exprestest gebruikt: een kweek wordt in een lus in 2 ml van het medium gebracht, ongeveer vier uur geïncubeerd, vervolgens worden reagentia toegevoegd in een gelijke hoeveelheid van 2-3 druppels, gemengd en de resultaat wordt na tien minuten geëvalueerd.
De controle is een van de veroorzakers van longontsteking Klebsiella pneumoniae - stam atcc 13883.
Evaluatie van het resultaat
Na de vereiste tijd na het toevoegen van de reagentia (van 5 tot 15 minuten), moet een kersenrode kleur worden waargenomen met een uitgesproken positieve reactie, rood en roze - met een zwak positieve reactie. Er wordt geen verandering geregistreerd als een negatief resultaat.
Overtollige kaliloog in een oplossing kan een imitatie van een positieve reactie geven, kleuring in een koperkleur. In dit geval moet de negatieve reactie van de geteste kolonie worden geregistreerd. Ook treedt koperkleuring op in gevallen waarin de beoordeling een uur na de introductie van de reagentia wordt gegeven.
Bij de beoordeling van het resultaat moet er rekening mee worden gehouden dat langdurig kweken van de onderzochte micro-organismen (meer dan drie dagen) leidt tot verzuring van het medium, wat kan leiden tot een verkeerde uitkomst van het onderzoek. De reactie kan licht positief zijn ofvals negatief.
Vereisten voor testreagentia
Voges-Proskauer-reagentia moeten voldoen aan eisen zoals correcte concentratie, hoge zuiverheid en stabiliteit, die wordt bereikt door juiste opslag.
Kant-en-klare testkits bevatten doorgaans reagentia voor 100 of meer toepassingen en worden geleverd in plastic of getinte glazen flesjes. De kwaliteit wordt geregeld door de relevante documentatie.
