Kweek van bacteriën: methoden, principes, stappen en voorwaarden

2024 Auteur: Angel Austin | [email protected]. Laatst gewijzigd: 2023-12-17 05:37

Micro-organismen in de natuur om ons heen zijn overal: in bodems, waterlichamen, op de oppervlakken van verschillende objecten, mensen en dieren worden er door bewoond. Dit alles kan dienen als bron van microbiële besmetting van voedsel, medicijnen en productielijnen. Het kweken van bacteriën is nodig om hun eigenschappen, behoeften en kenmerken te bestuderen. Dit is op zijn beurt een belangrijke stap in de ontwikkeling van verschillende medicijnen, laboratoriumdiagnose van ziekten, de berekening van productiereactoren en nog veel meer.

Algemene concepten

Kweek van bacteriën in de microbiologie verwijst naar het kweken van micro-organismen in het laboratorium. Op hun beurt worden microben die op een geselecteerd voedingsmedium zijn gegroeid, een cultuur genoemd. Culturen kunnen worden gemengd als ze worden gevormd door verschillende soorten micro-organismen, en puur als ze worden vertegenwoordigd door slechts één type bacterie.

Als voedingEr wordt slechts één cel in het medium geplaatst en een groep individuen wordt verkregen als gevolg van de reproductie, dan wordt deze reeks micro-organismen een kloon genoemd. Wanneer een kloon zich zo ontwikkelt dat hij met het blote oog zichtbaar wordt, wordt deze verzameling bacteriën een kolonie genoemd.

Gewoonlijk wordt het kweken van bacteriën geïsoleerd uit verschillende bronnen afzonderlijk van elkaar uitgevoerd. Elke afzonderlijk gekweekte groep microben wordt een stam genoemd. Dus als één type stafylokokken wordt geïsoleerd uit drie bronnen (of verschillende delen van hetzelfde product, verschillende mensen), spreken ze over drie stammen van dit type stafylokokken.

Bacteriëngroeifactoren

Deze omvatten verschillende aminozuren, lipiden, purinebasen en andere verbindingen die nodig zijn voor de ontwikkeling van micro-organismen. Sommige microben kunnen zelfstandig de stoffen produceren die ze nodig hebben, terwijl andere ze in afgewerkte vorm moeten ontvangen. Afhankelijk van de behoeften van micro-organismen in bepaalde groeifactoren, worden identificatie en differentiatie van bacteriën uitgevoerd. Deze parameter is ook belangrijk voor de juiste bereiding van een voedingsbodem voor laboratorium- en biotechnologisch werk:

Aminozuren. Bacteriën kunnen een bepaald aminozuur of een bepaalde groep zuren nodig hebben. Clostridia hebben dus leucine en tyrosine nodig, streptokokken hebben leucine en arginine nodig. Micro-organismen die aminozuren van buitenaf nodig hebben om te groeien, worden auxotrofen genoemd.
Purine- en pyrimidinebasen, evenals hun derivaten (adenine, guanine en andere). Ze zijn een belangrijke factor in de groei van velenStreptococcus soorten.
Vitaminen. Ze maken deel uit van de co-enzymen die bacteriën nodig hebben. Dus nicotinezuur, evenals zijn amide, die deel uitmaken van NAD en NADP, is nodig voor difterie en shigella corynebacteriën. Thiamine, als integraal onderdeel van pyrofosfaat, wordt vereist door Staphylococcus aureus, pneumococcus, brucella. Pantotheenzuur, dat deel uitmaakt van het CoA-co-enzym, wordt vereist door tetanusbacillen en bepaalde soorten streptokokken. Cytochromen, en dus het foliumzuur, hemes en biotine waaruit ze bestaan, zijn nodig voor Mycobacterium tuberculosis en Haemophilus influenzae.

Omgevingsvereisten

Voorwaarden voor kweekmedia voor het kweken van bacteriën:

Voeding. Ze moeten bovendien stoffen bevatten in een licht verteerbare vorm die nodig zijn voor micro-organismen om te voeden en energie aan te vullen. Deze omvatten organogenen en mineralen. Sommige micro-organismen hebben bovendien vitamines en aminozuren nodig die ze niet zelf kunnen synthetiseren.
Optimale pH-waarde. Het beïnvloedt de doorlaatbaarheid van het celmembraan en daarmee het vermogen om voedingsstoffen door de bacterie op te nemen. Meestal moet de pH-waarde 7, 2-7, 4 zijn. Veel micro-organismen produceren in de loop van hun leven producten met zure of alkalische reacties, en om de pH van het voedingsmedium niet te veranderen, het moet worden gebufferd.
Isotoon. De osmotische druk in het voedingsmedium voor het kweken van bacteriën moet dezelfde waarden hebben alsbinnen microbiële cellen. Het komt meestal overeen met een 0,5% NaCl-oplossing.
Steriliteit. Dit is te wijten aan het feit dat het verschijnen van vreemde bacteriën de resultaten van de studie van de geanalyseerde stam zal vervormen.
Vochtigheidsniveau. Deze indicator zou, samen met de consistentie van het medium, optimale eigenschappen moeten hebben voor een bepaald type bacterie.
Redoxpotentiaal (RH2). Het toont de verhouding van stoffen die elektronen afstaan en accepteren, evenals het niveau van zuurstofverzadiging van het voedingsmedium. Voor aeroben en anaëroben verschillen de omstandigheden voor het kweken van bacteriën in deze indicator enigszins. Anaërobe micro-organismen reproduceren het best bij RH2-waarden onder de 5 en aerobe micro-organismen minstens 10.
Uniformiteit. Het is belangrijk dat het kweekmedium constante hoeveelheden van de afzonderlijke ingrediënten bevat. Daarnaast hebben heldere oplossingen de voorkeur, die het gemakkelijker maken om de gewasgroei te monitoren of contaminatie op te merken.

Soorten cultuurmedia

De keuze van een bepaald medium voor het kweken van micro-organismen wordt beïnvloed door vele factoren, waaronder de kenmerken van hun voeding en het doel van het onderzoek. De belangrijkste kenmerken die ten grondslag liggen aan de classificatie van voedingsmedia zijn:

1. Componenten. Volgens de oorspronkelijke stoffen die zijn gebruikt om het substraat te maken, onderscheiden ze:

natural, die zijn bereid uit producten van dierlijke of plantaardige oorsprong (bijv. vlees, melk, fruit) en geschikt zijn voor gemengde teeltgewassen;
semi-synthetisch, waarbij dure natuurlijke voedingsproducten worden vervangen door non-foodproducten (bijvoorbeeld beendermeel, bloedstolsels), en die optimaal zijn voor het kweken van bepaalde soorten bacteriën of het isoleren van hun stofwisselingsproducten van de omgeving;
synthetische, die worden bereid uit precieze hoeveelheden chemische verbindingen, hebben een bekende constante samenstelling en zijn gemakkelijk reproduceerbaar.

2. Consistentie (dichtheid). Onderscheid omgevingen:

vloeistof;
dicht;
semi-vloeibaar.

De laatste twee worden bereid uit speciale oplossingen of vloeibare stoffen met toevoeging van agar-agar of gelatine om de vereiste dichtheid te creëren. Bovendien is een dichte omgeving voor de groei van bacteriën gestold bloedserum, aardappelen, silicagelmedia, carrageen.

3. Verbinding. Op basis hiervan zijn de omgevingen:

simpel, waarvan de lijst kort is, is Meat Peptone Broth (MBB), Hottinger Bouillon en Agar, Meat Peptone Agar (MPA), voedingsgelatine en peptonwater.
complex, bereid uit eenvoudige met toevoeging van bloed, wei, koolhydraten en andere stoffen.

4. Afspraak. De volgende voedingsmedia worden onderscheiden:

main worden gebruikt om veel pathogene microben te laten groeien (meestal eenvoudige samenstelling);
speciale worden gebruikt om bacteriën te isoleren en te kweken die niet op eenvoudige substraten groeien;
selectief (ze zijn ook selectief) zijn geschikt voor het isoleren van een specifiek type bacteriën en remmen de groei van geassocieerde microben (selectiviteitgemaakt door bepaalde stoffen aan de media toe te voegen, zoals antibiotica of zouten, of door de pH aan te passen);
differentiële diagnostiek maakt het mogelijk om het ene type bacterie van het andere te onderscheiden door de enzymatische activiteit te beoordelen, bijvoorbeeld van het medium;
conserveringsmiddelen zijn nodig voor de eerste inoculatie met daaropvolgend transport van monsters, omdat ze de dood van micro-organismen voorkomen en de groei van andere bacteriën remmen.

Mediavoorbereiding

De belangrijkste stap bij het kweken van anaërobe bacteriën is de bereiding van een geschikte voedingsbodem. Nadat de optimale parameters zijn geselecteerd, gaat u verder met de volgende stappen:

wegen, door een monster van componenten te selecteren op een analytische balans;
oplossing uitgevoerd in gedestilleerd water verwarmd tot 70 ° C, en fosfaten, micro- en macrozouten worden afzonderlijk opgelost;
twee minuten koken in een waterbad;
pH-bepaling door indicatorpapier of potentiometer;
filtratie door natte doek- of papieren filters voor zowel vloeibare als gesmolten dichte media, en door een katoenen gaasfilter voor agarmedia;
botteling uitgevoerd op 3/4 capaciteit;
mediumafhankelijke sterilisatie;
controle op steriliteit wordt uitgevoerd door twee dagen in een thermostaat te zetten, gevolgd door bezichtiging;
chemische controle om de pH en inhoud van de noodzakelijke. vast te stellenartikelen;
biologische controle door middel van proefinoculatie.

Sterilisatie van glaswerk en media

Een van de basisprincipes van het kweken van bacteriën is steriliteit. De groei en ontwikkeling van vreemde micro-organismen kan de eigenschappen van het voedingsmedium beïnvloeden door de chemische samenstelling en pH te veranderen. Sterilisatie is de belangrijkste voorwaarde voor het kweken van zuivere culturen. In de praktijk betekent deze term de methoden van vernietiging van absoluut alle levensvormen op het oppervlak en in het volume van gesteriliseerde objecten. Vaten, gebruikte instrumenten, media en andere items die tijdens het onderzoek zijn gebruikt, worden gesteriliseerd.

Sommige soorten sterilisatie:

Ontsteking. Sterilisatie van lussen en naalden voor het zaaien, glasplaatjes, sommige instrumenten kunnen worden uitgevoerd met een brander of spirituslamp.
Kokend. Geschikt voor het hanteren van spuiten, naalden, voedsel, maar doodt geen bacteriesporen.
Droge hitte sterilisatie. Het wordt uitgevoerd in een speciale droogkast en is geschikt voor het verwerken van kolven, reageerbuizen en ander laboratoriumglaswerk.
Stoomsterilisatie. Uitgevoerd in een autoclaaf, is deze methode zeer effectief. Maar het is niet geschikt voor voedingsmedia die eiwitten of andere verbindingen bevatten die bij hoge temperaturen afbreken. Meer sparen kan tyndalisatie worden genoemd. Het wordt uitgevoerd in de Koch Boiler en combineert de kieming van sporen met hun vernietiging.
Pasteurisatie. Het wordt gebruikt voor media die hun eigenschappen veranderen wanneer ze worden gekookt (bijvoorbeeld melk, wijn, bier), in staat om:hen te ontdoen van niet-sporendragende micro-organismen. De verwerkingstemperatuur is slechts een kwartier tot dertig minuten 50-60 ° C. In sommige gevallen wordt koude sterilisatie gebruikt, uitgevoerd met behulp van filters of UV-stralen.

Bacteriën teeltomstandigheden

De groei en ontwikkeling van bacteriën is alleen mogelijk onder bepaalde factoren en de waarden van elk van hen:

1. Temperatuur. Er zijn drie groepen bacteriën die verschillen in temperatuurvoorkeuren:

thermofielen, of warmteminnende microben, groeien bij 45-90°C, wat betekent dat ze zich niet vermenigvuldigen in menselijke en dierlijke organismen;
psychrofielen, of koudeminnende micro-organismen, geven de voorkeur aan temperaturen in het bereik van 5-15 ° C en worden gekweekt in koelhuizen;
mesofielen, ontwikkelen zich bij een temperatuur van 25-37 ° C, ze omvatten het grootste deel van de bacteriën.

2. Licht. Het is een kenmerk van de teelt van fototrofe bacteriën, omdat ze het fotosyntheseproces uitvoeren. Maar voor de meeste microben is verlichting geen vereiste. En zelfs omgekeerd kan zonne-ultraviolet hun ontwikkeling onderdrukken.

3. Water. Alle micro-organismen hebben water nodig in een toegankelijke (vloeibare) vorm. Dat is de reden waarom diepvriesproducten weinig tot geen bacteriegroei hebben.

4. Zuurgraad van het milieu. Dit principe van het kweken van bacteriën is hierboven al uitgebreid besproken.

5. Beluchting. Zuurstof, als chemisch element, is een integraal onderdeel van water en een aanzienlijk aantal verbindingen die worden gebruikt voor:kweek van micro-organismen. Gasvormige zuurstof kan ook in opgeloste vorm in water en andere vloeistoffen aanwezig zijn. Een aanzienlijk deel van de bacteriën heeft een constante toevoer van zuurstofmoleculen nodig. Maar voor een aantal micro-organismen is het niet nodig, of erger nog, gasvormige zuurstof is giftig voor hen, omdat ze geen katalase en peroxidase bevatten, die giftige ademhalingsproducten vernietigen. Daarom is de belangrijkste stap bij het kweken van anaërobe bacteriën de verwijdering van O₂-moleculen uit het voedingsmedium.

6. Kweek van micro-organismen. Het kweken van aërobe en anaërobe bacteriën wordt uitgevoerd in verschillende lagen van de omgeving en in verschillende modi.

Kweek van aerobe micro-organismen

Kweek van aërobe bacteriën vereist moleculaire zuurstof. Om zuivere culturen van aeroben te verkrijgen die met succes kunnen worden gebruikt in de geneeskunde en de voedingsindustrie, worden de volgende methoden gebruikt:

oppervlak groeit op dichte media of in vloeibare media (hun dunne laag) wanneer zuurstof rechtstreeks uit de lucht komt;
diep kweken in vloeibare media, wanneer een toename van de hoeveelheid opgeloste zuurstof wordt bereikt door constante beluchting.

Kweek van anaërobe micro-organismen

Het basisprincipe van het kweken van bacteriën van dit type is hun minimale contact met zuurstof uit de lucht. Het scheppen van voorwaarden voor hun groei is veel moeilijker dan voor aeroben. De volgende methoden worden gebruikt om anaëroben te isoleren uit moleculaire O₂:

Fysiek. Deze kweekmethode van anaërobe bacteriën wordt gereduceerd tot hun kweek in een speciaal vacuümapparaat - een microanaerostaat. De lucht erin wordt vervangen door een speciaal gasmengsel van stikstof met toevoeging van 10% waterstof en 5% kooldioxide.
Chemisch. Deze omvatten: gebruik van absorberende middelen (bijv. Fe, Na₂S₂O₄, CuCl) of reductiemiddelen (zoals ascorbinezuur).
Biologisch. Het komt neer op het samen kweken van aeroben en anaeroben in een gesloten systeem. Deze methode voor het kweken van bacteriën omvat het zaaien van de ene helft van een petrischaal met enkele van de aerobe soorten bacteriën en de andere helft met de bestudeerde anaërobe. De ontwikkeling begint op het moment dat alle zuurstof op is.

De volgende zaaimethoden zijn geschikt voor het kweken van anaërobe bacteriën:

in de oppervlaktelaag;
in de oppervlaktelaag gevuld met steriele paraffine;
in het midden van een dichte voedingsbodem;
in diepe lagen viskeuze media.

Puur cultuur verkrijgen

Microbiologen werken meestal met monsters die door veel verschillende soorten microben worden bewoond. Om de systematische positie van micro-organismen (familie, geslacht, soort) te bepalen en om hun kenmerken te bestuderen, is het echter noodzakelijk om ze te isoleren en een zuivere cultuur te kweken. Ze zijn van groot belang in veel voedingsindustrieën, bijvoorbeeld kaas, brood, kwas, wijn, enz. De teelt van melkzuurbacteriën maakt het mogelijk omeen essentieel onderdeel voor de productie van gefermenteerde melkproducten, deeg, cacao, kuilvoer en zelfs plastic.

De methode voor het isoleren van een zuivere cultuur in een dicht medium is gebaseerd op de mechanische scheiding van micro-organismecellen met hun daaropvolgende geïsoleerde kweek. Het monster wordt overgebracht naar een steriel volume water of zoutoplossing (volume 10-100 ml) en vervolgens twee minuten geschud. Om micro-organismen te extraheren die zich in de dikte van het onderzochte materiaal bevinden (bijvoorbeeld worst of kaas), worden de monsterstukken eerst met steriele instrumenten met zand ingewreven. Het materiaal dat een voorbereidende voorbereiding heeft ondergaan, met een gewicht van 1 g of een volume van 1 ml, wordt 10, 100, 1000, enz. maal verdund met steriel water. De mate van verdunning wordt gekozen die een concentratie van cellen geeft die overeenkomt met de mogelijkheden van de methode.

De daaropvolgende kweek van micro-organismen is het bereiden van een voedingsbodem. Meestal wordt gekozen voor een dicht medium (MPA). Het wordt eerst gesmolten en afgekoeld tot 45-50 °C, en pas daarna wordt het in verschillende petrischalen (drie tot vijf stukken) gegoten, op de bodem waarvan staafjes van de teststof met verschillende concentraties worden geplaatst. Vervolgens wordt het mengen van het nog niet bevroren voedingsmedium en het daarin ingebrachte materiaal uitgevoerd. Zo worden cellen op verschillende punten in het volume van het substraat gefixeerd.

Vervolgens worden petrischalen gedurende 2 dagen bij 22 °C in een thermostaat geplaatst. Gedurende deze tijd vermenigvuldigen de cellen zich zodanig dat de kolonie gevormd door elk van de cellen zichtbaar wordt voor het blote oog. Elk van hen is een zuivere cultuur van het type bacterie uit wiens cellen het isroos.

Daarna worden micro-organismen uit petrischalen in subcultuur gebracht in afzonderlijke reageerbuizen gevuld met een voedingsbodem. Op deze manier worden zuivere culturen geïsoleerd uit een mengmonster. Deze methode draagt de naam van de ontwikkelaar - R. Koch. Het wordt ook vaak de bekermethode of uitputtend zaaien genoemd. Na het verkrijgen van zuivere culturen van verschillende soorten bacteriën, worden hun vorm, sporen en families bepaald.

Alle werkzaamheden moeten worden uitgevoerd volgens de principes van asepsis. Om voortijdige ontwikkeling van micro-organismen te voorkomen, moet het onderzoek onmiddellijk na de bemonstering worden uitgevoerd. Kraanwater wordt geanalyseerd na het aftappen van de eerste porties, aangezien deze microben kunnen bevatten die zich in leidingen en kranen hebben opgehoopt. De microflora van fruit, bessen en groenten bevindt zich voornamelijk op het oppervlak (schil), daarom worden er wassingen van uitgevoerd. Om dit te doen, plaatst u de foetus in een steriele container en vult u deze met de benodigde hoeveelheid water. Daarna worden ze behoorlijk krachtig geschud en wordt het water in een andere container gegoten. Gewassen van stoffen producten worden ook verkregen in wattenstaafjes, maar vooraf worden er stukjes van een bepaalde grootte uit gesneden.