Wat ligt ten grondslag aan DNA-hybridisatie? Hoewel de dubbelstrengs DNA-sequentie over het algemeen stabiel is onder fysiologische omstandigheden, zal het veranderen van deze omstandigheden in het laboratorium (meestal door de omgevingstemperatuur te verhogen) ervoor zorgen dat de moleculen zich in afzonderlijke strengen scheiden. Deze laatste zijn complementair aan elkaar, maar kunnen ook andere sequenties in hun omgeving aanvullen. Door de omgevingstemperatuur te verlagen, kunnen de enkelstrengs moleculen met elkaar versmelten of "hybridiseren". Dit is de DNA-hybridisatiemethode.
Het concept vanuit het oogpunt van moleculaire biologie
Wetenschappers die betrokken zijn bij zowel DNA-replicatie als de transcriptie van DNA in RNA vertrouwen op nucleotide-crossovers en moleculair-biologische technieken. Dit omvat Southern- en Northern-blots, polymerasekettingreactie (PCR) en de meeste DNA-RNA-hybridisatie- en sequencing-benaderingen.
Toepassing
Hybridisatie is de belangrijkste eigenschap van nucleotidesequenties en wordt gebruikt in tal van methoden van moleculaire biologie. De algehele genetische verwantschap van twee soorten kan worden bepaald door segmenten van hun DNA te hybridiseren (DNA-DNA-hybridisatie). Vanwege sequentieovereenkomsten tussen nauw verwante organismen, is een hogere temperatuur vereist om dergelijke DNA-hybriden te smelten in vergelijking met verder verwijderde organismen. Verschillende methoden gebruiken hybridisatie om de oorsprong van een DNA-monster te bepalen, waaronder de polymerasekettingreactie (PCR). Bij een andere methode worden korte DNA-sequenties gehybridiseerd met cellulair mRNA om tot expressie gebrachte genen te identificeren. Farmaceutische bedrijven onderzoeken het gebruik van antisense-RNA om te binden aan ongewenst mRNA, waardoor het ribosoom geen mRNA in eiwit kan omzetten.
DNA-DNA-hybridisatie verwijst in het algemeen naar een moleculair-biologische techniek die de mate van genetische overeenkomst meet tussen pools van DNA-sequenties. Het wordt vaak gebruikt om de genetische afstand tussen twee organismen te bepalen. Het is veel gebruikt in fylogenie en taxonomie.
Methodologie
DNA van één organisme werd gelabeld en vervolgens gemengd met ongelabeld DNA dat ermee vergeleken kon worden. Het mengsel wordt geïncubeerd om de DNA-strengen te laten dissociëren en vervolgens af te koelen om een geregenereerd hybride dubbelstrengs DNA te vormen. Gehybridiseerde sequenties met een hoge mate van overeenkomst zullen steviger binden en meer energie nodig hebben om ze te scheiden: d.w.z. ze scheiden wanneer ze worden verwarmd op een hogere temperatuur.temperatuur dan ongelijke sequenties, een proces dat bekend staat als "DNA smelten".
DNA smelten
Evaluatie van het smeltprofiel van het gehybridiseerde DNA, het dubbelstrengs DNA wordt gebonden aan een zogenaamde "kolom" en het resulterende mengsel wordt verwarmd. Bij elke stap wordt de kolom gewassen en de DNA-sequenties die smelten worden enkelstrengs en wassen van de kolom af. De temperaturen waarbij gelabeld DNA de kolom verlaat, weerspiegelt de mate van overeenkomst tussen sequenties (en het zelfvouwende patroon dient als controle). Deze resultaten worden gecombineerd om de mate van genetische overeenkomst tussen organismen te bepalen. Volgens de moderne microbiologie is DNA-hybridisatie onmogelijk zonder deze dingen te begrijpen.
Wanneer meerdere ribonucleïnezuur- (of deoxyribonucleïnezuur)-soorten op deze manier worden vergeleken, maken de overeenkomstwaarden het mogelijk om de soort in de fylogenetische boom te plaatsen. Daarom is dit een van de mogelijke benaderingen om moleculaire systematiek uit te voeren. Charles Sibley en John Ahlquist, de pioniers van deze techniek, gebruikten DNA-DNA-hybridisatie om de fylogenetische relaties van vogels (Sibley-Ahlquist-taxonomie) en primaten te bestuderen.
Belang voor biologie
DNA-DNA-hybridisatie is de gouden standaard voor het onderscheiden van bacteriesoorten, met een overeenkomstwaarde van meer dan 70%, wat aangeeft dat de vergeleken stammen tot verschillende soorten behoren. In 2014 werd een drempel van 79% gelijkenis voorgesteld voor het scheiden van een bacteriële ondersoort.
Critici beweren dat de techniek onnauwkeurig is voor het vergelijken van nauw verwante soorten, aangezien elke poging om verschillen tussen orthologe sequenties tussen organismen te meten wordt overweldigd door de hybridisatie van paraloge tegenhangers in het genoom van een organisme. DNA-sequencing en computationele sequentievergelijkingen zijn momenteel de meest gebruikte methode voor het bepalen van genetische afstand, hoewel deze benadering nog steeds wordt gebruikt in de microbiologie om bacteriën te helpen identificeren.
De huidige manier is om DNA-DNA-hybridisatie in siliconen uit te voeren met behulp van volledig of gedeeltelijk gesequenced genomen. De door de DSMZ ontwikkelde GGDC is de meest nauwkeurige bekende tool voor het berekenen van DDH-achtige waarden. Naast andere algoritmische verbeteringen lost het het probleem met paraloge sequenties op door ze zorgvuldig te filteren uit overeenkomsten tussen twee genoomsequenties.
FISH-methode
Fluorescentie In Situ Hybridisatie (FISH) is een laboratoriumtechniek die wordt gebruikt om DNA te detecteren en te sequencen, vaak op een specifiek chromosoom.
In 1969 publiceerden Joseph Gall en Mary Lou Pardu een paper waarin ze aantoonden dat radioactieve kopieën van een ribosomale DNA-sequentie kunnen worden gebruikt om complementaire DNA-sequenties in de kern van een kikkerei te detecteren. Sinds deze oorspronkelijke waarnemingen hebben veel verfijningen de veelzijdigheid vergroot ende gevoeligheid van de procedure zodanig dat in situ hybridisatie ("in place", Latijn) nu wordt beschouwd als een belangrijk hulpmiddel in de cytogenetica. (De term in situ wordt nu ook gebruikt om te verwijzen naar het beginstadium van carcinoomgroei, wanneer alleen epitheelweefsel betrokken is bij het pathologische proces.)
Fluorescerende hybridisatiesequentie
RNA-probes kunnen worden ontworpen voor elk gen of elke sequentie binnen een gen om lncRNA en miRNA-mRNA in weefsels en cellen te visualiseren. FISH wordt gebruikt voor het bestuderen van de cyclus van celreproductie, in het bijzonder de nucleaire interfase voor eventuele chromosomale afwijkingen. Met FISH kunt u een grote reeks archiefgevallen analyseren, het is veel gemakkelijker om het geïdentificeerde chromosoom te identificeren door een sonde te maken met een kunstmatige chromosoombasis die vergelijkbare chromosomen zal aantrekken.
Hybridisatiesignalen voor elke probe wanneer een nucleaire afwijking wordt gedetecteerd: elke mRNA- en lncRNA-detectieprobe bestaat uit 20 paar oligonucleotiden, elk paar beslaat een ruimte van 40-50 bp. blz. Probes gebruiken gepatenteerde chemie om mRNA te detecteren.
Hybridisatie met DNA-probes
Probes worden vaak gemaakt van DNA-fragmenten die zijn geïsoleerd, gezuiverd en geamplificeerd voor gebruik bij het ontwerp van het menselijk genoom. De grootte van het menselijk genoom is zo groot in vergelijking met de lengte die direct kan worden gesequenced, dat het nodig is het in te delen infragmenten. Uiteindelijk werden deze fragmenten geordend door een kopie van elk fragment te verteren in nog kleinere eenheden met behulp van sequentie-specifieke endonucleasen om de grootte van elk klein fragment te meten met behulp van grootte-uitsluitingschromatografie met behulp van deze informatie om te bepalen waar grote fragmenten elkaar overlappen.
Om de elementen met hun individuele DNA-sequenties te behouden, werden de fragmenten toegevoegd aan een systeem van steeds herhalende bacteriële populaties. Klonale populaties van bacteriën, waarbij elke populatie een enkel kunstmatig chromosoom in stand houdt, worden opgeslagen in verschillende laboratoria over de hele wereld. Kunstmatige chromosomen (BAC's) kunnen worden gekweekt, geëxtraheerd en gelabeld in elk laboratorium met een bibliotheek. Genomische bibliotheken zijn vaak vernoemd naar de instellingen waar ze zijn ontwikkeld. Een voorbeeld is de RPCI-11-bibliotheek, genoemd naar het Roswell Cancer Institute in Buffalo (New York, VS). Deze fragmenten vormen ongeveer 100 duizend basenparen en vormen de basis van de meeste FISH-sondes.
