Gramkleuring wordt veel gebruikt in de microbiologie, omdat het een van de gemakkelijkste manieren is om bacteriën te differentiëren op basis van de samenstelling van hun celwand. Volgens Gram kunnen alle bacteriën worden onderverdeeld in grampositief (Gram (+)) en gramnegatief (Gram (-)). De Gram-kleuringsmethode is ontwikkeld in 1884 en heeft sindsdien niet aan populariteit ingeboet, hoewel deze verschillende keren is gewijzigd.
Celwandstructuur
Gramkleuring onthult of een bacterie Gram-positief of Gram-negatief is. De verdeling van bacteriën in Gram (+) en Gram (-) wordt uitgevoerd in overeenstemming met de structuur van hun celwand.
De celwand bevat de grootste hoeveelheid peptidoglycaan (mureïne) - een complexe stof, waaronder peptapeptide en glycaan. Het glycaan bestaat uit afwisselende resten van N-acetylglucosamine en N-acetylmuraminezuur die met elkaar zijn verbonden door -1,4-glycoside bindingen. Peptidoglycan zorgt voor behoud van de celvorm, osmotische bescherming en antigene functies.
Belangrijkste verschillen tussen Gram-positieve en Gram-negatieve bacteriën
Verschillende bacteriën hebben verschillende diktes van de peptidoglycaanlaag. Bij bacteriën die als grampositief zijn geclassificeerd, varieert het van 15 tot 80 nm, terwijl het in gramnegatief van 2 tot 8 nm is. Tegelijkertijd hebben Gram-negatieve bacteriën een speciale structuur onder de peptidoglycaanlaag, die Gram-positieve bacteriën niet hebben - de periplasmatische ruimte. Deze ruimte is gevuld met hydrolytische enzymen - β-lactamase, ribonuclease 1, fosfatase. Het zijn deze enzymen die verantwoordelijk zijn voor de resistentie van Gram-negatieve bacteriën tegen veel antibiotica.
De Gram(-) peptidoglycaanlaag van bacteriën is gebonden aan lipopolysaccharide, een antigene structuur die endotoxine bevat. In Gram(+)-bacteriën vervullen teichoïnezuren vergelijkbare functies.
Gram-negatieve bacteriën hebben een extra structuur - het buitenmembraan.
De essentie van de kleurmethode
Voordat je begint met kleuren, worden er uitstrijkjes van de bestudeerde bacteriën gemaakt. Hiervoor wordt water op een glasplaatje gedruppeld en daar wordt een kweek van micro-organismen met een bacterielus toegevoegd. Vervolgens, nadat het water volledig is opgedroogd, wordt het uitstrijkje gefixeerd - het glasplaatje wordt meerdere keren over de brandervlam gedragen. Gramkleuring is effectiever dan kleuring met levende bacteriën - kleurstofmoleculen binden beter aan dode cellen.
Het kleuren gebeurt in verschillende fasen:
- Kleine stukjes filtreerpapier worden op een vast uitstrijkje geplaatst en de hoofdkleurstof wordt gegoten - gentiaanviolet of methyleenblauw.
- Verwijder na 3-5 minuten het gekleurde filterpapier en vul het uitstrijkje gedurende 1 minuut met Lugol's oplossing. In dit geval wordt het preparaat donkerder.
- De Lugol-oplossing wordt afgetapt en het uitstrijkje wordt behandeld met pure ethylalcohol: een paar druppels worden op het preparaat gedruppeld, na 20 seconden uitgelekt. De procedure wordt 2-3 keer herhaald.
- Spoel het objectglaasje af met testvoorbereiding met gedestilleerd water.
- Produceer extra kleuring - maak de bereiding af met fuchsine. Na 1-2 minuten is de kleurstof afgewassen.
- Bekijk het uitstrijkje onder een microscoop nadat het water is opgedroogd. Gram-positieve bacteriën zullen blauwviolet zijn, Gram-negatieve bacteriën zullen roze of rood zijn.
Oorzaken van verschillende kleurpatronen
Zoals hierboven beschreven, kleurt Gram-kleuring van bacteriën Gram-positieve bacteriën blauwviolet en Gram-negatieve bacteriën rood of roze. De reden voor de differentiële kleuring van bacteriën door deze methode is dat nadat de oplosbare vorm van gentiaanviolet de cel is binnengekomen, de kleurstof overgaat in de onoplosbare jodiumvorm. Tijdens de behandeling van bacteriën met ethylalcohol worden onder invloed van dit niet-polaire oplosmiddel lipiden uit het membraan gehaald. Het membraan wordt dan poreus en vormt niet langer een significante barrière tegen het uitlogen van de kleurstof. Echterpeptidoglycaan is beter bestand tegen niet-polaire oplosmiddelen, waaronder alcohol. Hij is het die het uitwassen van de kleurstof voorkomt, zodat bacteriën met een dikke mureïnelaag blauwviolet (grampositief) worden en na behandeling met alcohol veranderen ze hun kleur niet.
Dunne mureïnelaag van gramnegatieve bacteriën kan de kleurstofmoleculen niet in de cel vasthouden, dus na de inwerking van alcohol worden ze kleurloos - ze kleuren gramnegatief.
Na blootstelling van een uitstrijkje aan fuchsine blijven Gram-gekleurde bacteriën blauwviolet, terwijl Gram-negatieve bacteriën rozerood worden.
Voorbeelden van Gram(+) en Gram(-) bacteriën
Gram-negatieve bacteriën omvatten cyanobacteriën, zwavelbacteriën, ijzerbacteriën, chlamydia, rickettsiae, azijnbacteriën, veel methylobacteriën, thionbacteriën, arsenitobacteriën, carboxybacteriën.
Bifidobacteriën, veel waterbacteriën, streptokokken en stafylokokken zijn grampositief.
